5-Methylpyrazine-2-carboxylic acid (MPCA) is an important pharmaceutical intermediate and is used in the production of hypoglycemic agents and lipid-lowering drugs. This work aimed to develop a whole-cell biocatalytic process for the efficient synthesis of MPCA from 2, 5-dimethylpyrazine (DMP). Firstly, a whole-cell biocatalyst Escherichia coli strain was constructed by plasmid-based expression of xylene monooxygenase (XMO), benzyl alcohol dehydrogenase (BADH), and benzaldehyde dehydrogenase (BZDH) from Pseudomonas putida ATCC 33015, resulting in MPCA titer of 5.0 g/L. Then, the reaction conditions were optimized and the MPCA titer was further increased to 9.1 g/L. Next, the Ribosome Binding Site (RBS) Calculator v2.0 was used to predict and compare the translation initiation rates of the RBS sequences preceding xylM and xylA genes, encoding the two subunits of XMO. By optimizing the RBS sequences preceding xylA, the MPCA titer was increased to 10.2 g/L and the yield of MPCA on DMP reached 0.665 mol/mol. Finally, to achieve plasmid-free production of MPCA, we integrated the genes encoding for XMO, BADH and BZDH in the genome by using CRISPR/Cas9 and further fine-tuned the copy number ratios of xylM and xylA in the genome, improving the MPCA titer to 15.6 g/L and the yield of MPCA on DMP to 1.0 mol/mol. This work developed a high-yield and plasmid-free biocatalysis process for the environmentally friendly production of MPCA with 100% substrate conversion, and paved the way for the commercial production of MPCA in the future.

中文翻译：

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大肠杆菌组合遗传元件工程和基因组工程高产无质粒生物催化生产5-甲基吡嗪-2-羧酸

5-甲基吡嗪-2-羧酸（MPCA）是一种重要的医药中间体，用于生产降血糖药和降脂药。这项工作旨在开发一种全细胞生物催化工艺，以从 2, 5-二甲基吡嗪 (DMP) 有效合成 MPCA。首先，通过基于恶臭假单胞菌ATCC 33015的二甲苯单加氧酶（XMO）、苯甲醇脱氢酶（BADH）和苯甲醛脱氢酶（BZDH）的质粒表达构建全细胞生物催化剂大肠杆菌菌株，MPCA滴度为5.0 g /L。然后，优化反应条件，MPCA效价进一步提高到9.1 g/L。接下来，使用核糖体结合位点 (RBS) 计算器 v2.0 来预测和比较 xylM 和 xylA 基因之前的 RBS 序列的翻译起始率，编码 XMO 的两个亚基。通过优化xylA之前的RBS序列，MPCA滴度提高到10.2 g/L，MPCA在DMP上的产率达到0.665 mol/mol。最后，为了实现 MPCA 的无质粒生产，我们利用 CRISPR/Cas9 整合了基因组中编码 XMO、BADH 和 BZDH 的基因，并进一步微调了基因组中 xylM 和 xylA 的拷贝数比，提高了 MPCA滴度达到 15.6 g/L，DMP 上 MPCA 的产率达到 1.0 mol/mol。该工作开发了一种高产、无质粒的生物催化工艺，可用于环境友好地生产 100% 底物转化的 MPCA，为未来 MPCA 的商业化生产铺平了道路。665 摩尔/摩尔。最后，为了实现 MPCA 的无质粒生产，我们利用 CRISPR/Cas9 整合了基因组中编码 XMO、BADH 和 BZDH 的基因，并进一步微调了基因组中 xylM 和 xylA 的拷贝数比，提高了 MPCA滴度达到 15.6 g/L，DMP 上 MPCA 的产率达到 1.0 mol/mol。该工作开发了一种高产、无质粒的生物催化工艺，可用于环境友好地生产 100% 底物转化的 MPCA，为未来 MPCA 的商业化生产铺平了道路。665 摩尔/摩尔。最后，为了实现 MPCA 的无质粒生产，我们利用 CRISPR/Cas9 整合了基因组中编码 XMO、BADH 和 BZDH 的基因，并进一步微调了基因组中 xylM 和 xylA 的拷贝数比，提高了 MPCA滴度达到 15.6 g/L，DMP 上 MPCA 的产率达到 1.0 mol/mol。这项工作开发了一种高产、无质粒的生物催化工艺，用于环保生产 MPCA，底物转化率为 100%，为未来 MPCA 的商业化生产铺平了道路。