Neural circuits interconnect to organize large-scale networks that generate perception, cognition, memory, and behavior. Information in the nervous system is processed both through parallel, independent circuits and through intermixing circuits. Analyzing the interaction between circuits is particularly indispensable for elucidating how the brain functions. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein (G) gene-deleted rabies viral vectors (RVΔG) comprises a powerful approach for studying the structure and function of neural circuits. Pseudotyping of RVΔG with the foreign envelope EnvA permits expression of transgenes such as fluorescent proteins, genetically-encoded sensors, or optogenetic tools in cells expressing TVA, a cognate receptor for EnvA. Trans-complementation with rabies virus glycoproteins (RV-G) enables trans-synaptic labeling of input neurons directly connected to the starter neurons expressing both TVA and RV-G. However, it remains challenging to simultaneously map neuronal connections from multiple cell populations and their interactions between intermixing circuits solely with the EnvA/TVA-mediated RV tracing system in a single animal. To overcome this limitation, here, we multiplexed RVΔG circuit tracing by optimizing distinct viral envelopes (oEnvX) and their corresponding receptors (oTVX). Based on the EnvB/TVB and EnvE/DR46-TVB systems derived from the avian sarcoma leukosis virus (ASLV), we developed optimized TVB receptors with lower or higher affinity (oTVB-L or oTVB-H) and the chimeric envelope oEnvB, as well as an optimized TVE receptor with higher affinity (oTVE-H) and its chimeric envelope oEnvE. We demonstrated independence of RVΔG infection between the oEnvA/oTVA, oEnvB/oTVB, and oEnvE/oTVE systems and in vivo proof-of-concept for multiplex circuit tracing from two distinct classes of layer 5 neurons targeting either other cortical or subcortical areas. We also successfully labeled common input of the lateral geniculate nucleus to both cortico-cortical layer 5 neurons and inhibitory neurons of the mouse V1 with multiplex RVΔG tracing. These oEnvA/oTVA, oEnvB/oTVB, and oEnvE/oTVE systems allow for differential labeling of distinct circuits to uncover the mechanisms underlying parallel processing through independent circuits and integrated processing through interaction between circuits in the brain.

中文翻译：

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用G缺失的狂犬病病毒向量进行多重神经回路追踪。

神经回路相互连接以组织产生感知，认知，记忆和行为的大规模网络。神经系统中的信息通过并行的独立电路和混合电路进行处理。为了阐明大脑的功能，分析电路之间的相互作用是必不可少的。用糖蛋白（G）基因缺失的狂犬病病毒载体（RVΔG）进行单突触回路追踪，是研究神经回路的结构和功能的有效方法。用外来包膜EnvA伪造RVΔG可以在表达TVA（EnvA的同源受体）的细胞中表达转基因，例如荧光蛋白，遗传编码的传感器或光遗传学工具。与狂犬病病毒糖蛋白（RV-G）的反式互补可直接对与表达TVA和RV-G的起始神经元相连的输入神经元进行反突触标记。然而，在单个动物中同时绘制来自多个细胞群的神经元连接及其在混合电路之间的相互作用与EnvA / TVA介导的RV追踪系统的结合仍然具有挑战性。为了克服这个限制，在这里，我们通过优化不同的病毒包膜（oEnvX）及其对应的受体（oTVX）对RVΔG电路进行了多路复用。基于源自禽肉瘤白血病病毒（ASLV）的EnvB / TVB和EnvE / DR46-TVB系统，我们开发了具有较低或较高亲和力的优化TVB受体（oTVB-L或oTVB-H）和嵌合包膜oEnvB，以及具有更高亲和力的优化TVE受体（oTVE-H）及其嵌合包膜oEnvE。我们证明了oEnvA / oTVA，oEnvB / oTVB和oEnvE / oTVE系统之间RVΔG感染的独立性，以及针对针对其他皮层或皮层下区域的两种不同类别的第5层神经元的两种不同类别的多重回路追踪的体内概念验证。我们还通过多重RVΔG示踪成功标记了外侧膝状核的共同输入到小鼠V1的皮质-皮质第5层神经元和抑制​​性神经元。这些oEnvA / oTVA，oEnvB / oTVB和oEnvE / oTVE系统允许对不同电路进行差异标记，以揭示通过独立电路进行的并行处理和通过大脑中电路之间的交互进行的集成处理的基础机制。我们证明了oEnvA / oTVA，oEnvB / oTVB和oEnvE / oTVE系统之间RVΔG感染的独立性，以及针对针对其他皮层或皮层下区域的两种不同类别的第5层神经元的两种不同类别的多重回路追踪的体内概念验证。我们还通过多重RVΔG示踪成功标记了外侧膝状核的共同输入到小鼠V1的皮质-皮质第5层神经元和抑制​​性神经元。这些oEnvA / oTVA，oEnvB / oTVB和oEnvE / oTVE系统允许对不同电路进行差异标记，以揭示通过独立电路进行的并行处理和通过大脑中电路之间的交互进行的集成处理的基础机制。我们证明了oEnvA / oTVA，oEnvB / oTVB和oEnvE / oTVE系统之间RVΔG感染的独立性，以及针对针对其他皮层或皮层下区域的两种不同类别的第5层神经元的两种不同类别的多重回路追踪的体内概念验证。我们还通过多重RVΔG示踪成功标记了外侧膝状核的共同输入到小鼠V1的皮质-皮质第5层神经元和抑制​​性神经元。这些oEnvA / oTVA，oEnvB / oTVB和oEnvE / oTVE系统允许对不同电路进行差异标记，以揭示通过独立电路进行的并行处理和通过大脑中电路之间的交互进行的集成处理的基础机制。以及oEnvE / oTVE系统和体内概念验证，用于针对其他皮质或皮质下区域的两种不同类别的第5层神经元的两种不同类别的多路电路追踪。我们还通过多重RVΔG示踪成功标记了外侧膝状核的共同输入到小鼠V1的皮质-皮质第5层神经元和抑制​​性神经元。这些oEnvA / oTVA，oEnvB / oTVB和oEnvE / oTVE系统允许对不同电路进行差异标记，以揭示通过独立电路进行的并行处理和通过大脑中电路之间的交互进行的集成处理的基础机制。以及oEnvE / oTVE系统和体内概念验证，用于针对其他皮质或皮质下区域的两种不同类别的第5层神经元的两种不同类别的多路电路追踪。我们还通过多重RVΔG示踪成功标记了外侧膝状核的共同输入到小鼠V1的皮质-皮质第5层神经元和抑制​​性神经元。这些oEnvA / oTVA，oEnvB / oTVB和oEnvE / oTVE系统允许对不同电路进行差异标记，以揭示通过独立电路进行的并行处理和通过大脑中电路之间的交互进行的集成处理所基于的机制。我们还通过多重RVΔG示踪成功标记了外侧膝状核的共同输入到小鼠V1的皮质-皮质第5层神经元和抑制​​性神经元。这些oEnvA / oTVA，oEnvB / oTVB和oEnvE / oTVE系统允许对不同电路进行差异标记，以揭示通过独立电路进行的并行处理和通过大脑中电路之间的交互进行的集成处理所基于的机制。我们还通过多重RVΔG示踪成功标记了外侧膝状核的共同输入到小鼠V1的皮质-皮质第5层神经元和抑制​​性神经元。这些oEnvA / oTVA，oEnvB / oTVB和oEnvE / oTVE系统允许对不同电路进行差异标记，以揭示通过独立电路进行的并行处理和通过大脑中电路之间的交互进行的集成处理所基于的机制。