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Detection of extended‐spectrum beta‐lactamase cefotaxime resistance and virulence genes in Escherichia coli by duplex quantitative real time PCR and melt curve analysis
Letters in Applied Microbiology ( IF 2.0 ) Pub Date : 2020-01-29 , DOI: 10.1111/lam.13274 M Aijuka 1 , E M Buys 1
Letters in Applied Microbiology ( IF 2.0 ) Pub Date : 2020-01-29 , DOI: 10.1111/lam.13274 M Aijuka 1 , E M Buys 1
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Emerging virulent and antibiotic‐resistant pathogens present a global public health risk. Routine monitoring of prevalence within the clinical, environmental and food production setting is vital. Quantitative real‐time PCR (qPCR) coupled with melting curve analysis can rapidly and accurately characterize pathogens. We evaluated commercial qPCR mixes based on SYBR Green l and EvaGreen for developing an assay for simultaneously detecting antibiotic resistance (extended‐spectrum beta‐lactamase, ESBL and blaCTX‐M) and virulence (stx1, stx2 and eae) genes in Escherichia coli (n = 12) isolated from irrigation water and irrigated vegetables. SYBR Green and EvaGreen detected two amplicons (stx1 and blaCTX‐M) and (stx2 and eae) in a single reaction. A higher mean melting temperature (Tm) separation between targeted amplicons and smoother melting curves were observed with the EvaGreen suggesting better performance when targeting multiple amplicons. Through simple stepwise optimization of DNA, cycling, primers, reaction volume and melting curve scanning rate, we adopted a conventional PCR assay for detection of large amplicons (375–1580 bp) for qPCR. This may facilitate development of cost‐effective tailor‐made assays for rapid and accurate monitoring of emerging foodborne and environmental pathogens in resource constrained regions.
中文翻译：
双重定量实时PCR和熔解曲线分析检测大肠杆菌中的超广谱β-内酰胺酶头孢噻肟耐药性和毒力基因
新出现的剧毒和抗生素耐药病原体构成了全球公共卫生风险。在临床、环境和食品生产环境中对流行情况进行常规监测至关重要。定量实时 PCR (qPCR) 结合熔解曲线分析可以快速准确地表征病原体。我们评估了基于 SYBR Green l 和 EvaGreen 的商业 qPCR 混合物，以开发一种同时检测大肠杆菌（n = 12) 从灌溉水和灌溉蔬菜中分离。SYBR Green 和 EvaGreen 在一次反应中检测到两个扩增子（stx1 和 blaCTX-M）和（stx2 和 eae）。使用 EvaGreen 观察到目标扩增子之间更高的平均熔解温度 (Tm) 分离和更平滑的熔解曲线，表明在靶向多个扩增子时性能更好。通过对 DNA、循环、引物、反应体积和熔解曲线扫描率的简单逐步优化，我们采用传统的 PCR 检测方法检测 qPCR 的大扩增子 (375–1580 bp)。这可能有助于开发具有成本效益的定制化验，以快速准确地监测资源受限地区新出现的食源性和环境病原体。我们采用传统的 PCR 检测方法检测 qPCR 的大扩增子 (375–1580 bp)。这可能有助于开发具有成本效益的定制化验，以快速准确地监测资源受限地区新出现的食源性和环境病原体。我们采用传统的 PCR 检测方法检测 qPCR 的大扩增子 (375–1580 bp)。这可能有助于开发具有成本效益的定制化验，以快速准确地监测资源受限地区新出现的食源性和环境病原体。
更新日期：2020-01-29
中文翻译：
双重定量实时PCR和熔解曲线分析检测大肠杆菌中的超广谱β-内酰胺酶头孢噻肟耐药性和毒力基因
新出现的剧毒和抗生素耐药病原体构成了全球公共卫生风险。在临床、环境和食品生产环境中对流行情况进行常规监测至关重要。定量实时 PCR (qPCR) 结合熔解曲线分析可以快速准确地表征病原体。我们评估了基于 SYBR Green l 和 EvaGreen 的商业 qPCR 混合物，以开发一种同时检测大肠杆菌（n = 12) 从灌溉水和灌溉蔬菜中分离。SYBR Green 和 EvaGreen 在一次反应中检测到两个扩增子（stx1 和 blaCTX-M）和（stx2 和 eae）。使用 EvaGreen 观察到目标扩增子之间更高的平均熔解温度 (Tm) 分离和更平滑的熔解曲线，表明在靶向多个扩增子时性能更好。通过对 DNA、循环、引物、反应体积和熔解曲线扫描率的简单逐步优化，我们采用传统的 PCR 检测方法检测 qPCR 的大扩增子 (375–1580 bp)。这可能有助于开发具有成本效益的定制化验，以快速准确地监测资源受限地区新出现的食源性和环境病原体。我们采用传统的 PCR 检测方法检测 qPCR 的大扩增子 (375–1580 bp)。这可能有助于开发具有成本效益的定制化验，以快速准确地监测资源受限地区新出现的食源性和环境病原体。我们采用传统的 PCR 检测方法检测 qPCR 的大扩增子 (375–1580 bp)。这可能有助于开发具有成本效益的定制化验，以快速准确地监测资源受限地区新出现的食源性和环境病原体。
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