RNA silencing is an important antiviral mechanism in plants. Small interfering RNAs (siRNA) or short hairpin RNAs (shRNA) are key stimulators for RNA silencing by acting as executors of viral restriction. Here, we have utilized RNAi technology to suppress potato virus X (PVX) in a transgenic potato cultivar. A stable shRNA of 107 bp directed against a conserved region in the coat protein (CP) gene of PVX was designed with stem and loop sequences derived from a microRNA (miR403; an active regulatory miRNA in potato). The shRNA transgene was directionally cloned in a plant binary vector under the influence of the cauliflower mosaic virus 35S (CaMV35S) constitutive promoter. The pre-shRNA construct was introduced into the potato cultivar Sante through Agrobacterium and transgene insertion was confirmed by testing using PCR (polymerase chain reaction). Upon artificial inoculation of transgenic and non-transgenic potato lines with PVX, variable resistance was revealed through qRT-PCR among the transgenic potato lines. Compared to non-transgenic potato plants, the transgenic potato lines—D5, P3, P9, P14, P21, S11 and S21—showed undetectable levels of CP-PVX mRNA. However, the transgenic lines D4 and P16 exhibited 70% and 75%, respectively, reducing mRNA expression of CP-PVX. The transgenic potato lines remained healthy, with no detectable disease symptoms as compared to the control plants which showed chlorosis and mosaic symptoms. Hence, the expression of virus specific shRNAs is a novel, effective and predictable approach to engineer resistance against PVX in transgenic plants.

中文翻译：

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转基因马铃薯中小干扰 RNA 对马铃薯 X 病毒的体内基因沉默

RNA沉默是植物中重要的抗病毒机制。小干扰 RNA (siRNA) 或短发夹 RNA (shRNA) 通过充当病毒限制的执行者而成为 RNA 沉默的关键刺激物。在这里，我们利用 RNAi 技术抑制转基因马铃薯品种中的马铃薯病毒 X (PVX)。针对 PVX 外壳蛋白 (CP) 基因中保守区域的 107 bp 稳定 shRNA 设计为具有源自 microRNA（miR403；马铃薯中的活性调节 miRNA）的茎和环序列。在花椰菜花叶病毒 35S (CaMV35S) 组成型启动子的影响下，将 shRNA 转基因定向克隆到植物二元载体中。通过农杆菌将前 shRNA 构建体引入马铃薯栽培品种 Sante，并通过使用 PCR（聚合酶链反应）测试确认转基因插入。在用 PVX 人工接种转基因和非转基因马铃薯品系后，通过 qRT-PCR 揭示了转基因马铃薯品系之间的可变抗性。与非转基因马铃薯植株相比，转基因马铃薯品系——D5、P3、P9、P14、P21、S11 和 S21——表现出检测不到的 CP-PVX mRNA 水平。然而，转基因品系 D4 和 P16 分别表现出 70% 和 75%，降低了 CP-PVX 的 mRNA 表达。与表现出萎黄病和花叶症状的对照植物相比，转基因马铃薯品系保持健康，没有可检测的疾病症状。因此，病毒特异性 shRNA 的表达是一种新颖、有效和可预测的方法，可以在转基因植物中设计对 PVX 的抗性。通过 qRT-PCR 揭示了转基因马铃薯品系之间的可变抗性。与非转基因马铃薯植株相比，转基因马铃薯品系——D5、P3、P9、P14、P21、S11 和 S21——表现出检测不到的 CP-PVX mRNA 水平。然而，转基因品系 D4 和 P16 分别表现出 70% 和 75%，降低了 CP-PVX 的 mRNA 表达。与表现出萎黄病和花叶症状的对照植物相比，转基因马铃薯品系保持健康，没有可检测的疾病症状。因此，病毒特异性 shRNA 的表达是一种新颖、有效和可预测的方法，可以在转基因植物中设计对 PVX 的抗性。通过 qRT-PCR 揭示了转基因马铃薯品系之间的可变抗性。与非转基因马铃薯植株相比，转基因马铃薯品系——D5、P3、P9、P14、P21、S11 和 S21——表现出检测不到的 CP-PVX mRNA 水平。然而，转基因品系 D4 和 P16 分别表现出 70% 和 75%，降低了 CP-PVX 的 mRNA 表达。与表现出萎黄病和花叶症状的对照植物相比，转基因马铃薯品系保持健康，没有可检测的疾病症状。因此，病毒特异性 shRNA 的表达是一种新颖、有效和可预测的方法，可以在转基因植物中设计对 PVX 的抗性。转基因品系 D4 和 P16 分别表现出 70% 和 75%，降低了 CP-PVX 的 mRNA 表达。与表现出萎黄病和花叶症状的对照植物相比，转基因马铃薯品系保持健康，没有可检测的疾病症状。因此，病毒特异性 shRNA 的表达是一种新颖、有效和可预测的方法，可以在转基因植物中设计对 PVX 的抗性。转基因品系 D4 和 P16 分别表现出 70% 和 75%，降低了 CP-PVX 的 mRNA 表达。与表现出萎黄病和花叶症状的对照植物相比，转基因马铃薯品系保持健康，没有可检测的疾病症状。因此，病毒特异性 shRNA 的表达是一种新颖、有效和可预测的方法，可以在转基因植物中设计对 PVX 的抗性。