We describe how protease and protease inhibitor activity patterns vary during ontogenesis, with season, and in relation to caste and sex in the honey bee (Apis mellifera). Extraction of body surfaces with water and detergent was followed by the in vitro analysis of proteolytic activity and protease inhibitor level, as well as the electrophoretic separation of extracts in polyacrylamide gels. In in vitro experiments, we compared two groups of detectable proteolytic activities: neutral and alkaline water-soluble versus acidic detergent-soluble. The most active proteases appeared to be acidic ones and were detected on drone pupae in spring. The most distinct and most active protease bands in electrophoretic separations were those obtained for neutral and alkaline activities on queens in all seasons. The highest levels of protease inhibitor activities in vitro were obtained from worker samples in all seasons. The enzymatic properties suggest that all catalytic types of proteases were present in the extracts, but at different activity levels, depending on pH: asparagine and cysteine proteases at pH 2.5, cysteine proteases and metalloproteases at pH 7.0, and serine proteases at pH 11.5, respectively.ZusammenfassungBei verschiedenen Organismen, einschliesslich Schaben, Amphibien und Menschen, wurde bereits eine beschränkte Anzahl an Proteasen und/oder Proteaseinhibitoren auf der Körperoberfläche identifiziert. Dabei sind die Unterschiede innerhalb der Invertebraten und im Vergleich mit Vertebraten nur relativ gering. Untersuchungen basierend auf dem Genom der Honigbienen weisen bereits auf eine bestimmte Anzahl neuer Proteine, einschliesslich Kutikulaproteinen, hin, die auch Proteasen umfassen könnten. Ziel dieser Studie war die Beschreibung der Muster, der in vitro Aktivität und der Zymogramme der Proteasen der Körperoberfläche und ihrer natürlichen Inhibitoren im Verlauf der Ontogenese der Honigbiene (Apis mellifera). Dabei wurden auch Kasten- und Saisonunterschiede in Betracht gezogen.Adulte Honigbienen wurden entweder am Stockeingang abgefangen (Arbeiterinnen) oder aus dem Volk entommen (Königinnen und Drohnen). Puppen, Larven und Eier wurden aus Brutwaben gewonnen. Larven der ersten drei Larvenstadien wurden als „kleine Larven“ und die des vierten und fünften Larvenstadiums als „grosse Larven“ gepoolt. Alle Proben wurden mit destilliertem Wasser abgewaschen, um Verunreinigungen und nicht festhaftende Mikroorganismen zu entfernen. Anschliessend wurde mittels feuchter Baumwollstäbchen die Körperoberfläche abgewaschen. Aus den Baumwollstäbchen wurden dann die biologischen Proben ausgepresst. Für eine zweite Waschung wurde destilliertes Wasser mit 1 % Detergenz verwendet. Allgemeine Proteasenaktivitäten wurden am optimalen pH mittels Hämoglobin als Substrat bestimmt (Tab. I) In den Extrakten waren alle katalytischen Typen an Proteasen vertreten. Bei pH 2,5 hatten die Asparaginproteasen (inhibiert durch Pepstatin und DAN) und Cysteinproteasen (inhibiert durch Iodoacetamid und pCMB) ihre höchsten Werte; bei pH 7,0 erreichten die Cysteinproteasen und Metalloproteasen (inhibiert durch o-Phenantrolin) und bei pH 11,5 die Serinproteasen (inhibiert durch PMSF und STI) die höchsten Aktivitätswerte.Die Bestimmung der allgemeinen Niveaus der Aktivitäten der Proteaseninhibitoren wurde mit Pepsin als Proteasemarker bei saurem pH und mit Trypsin als Markerprotease für neutrale und basische pH-Werte durchgeführt. Elektrophoresen in 10 % Gelen erfolgten bei nichtdenaturierenden Bedingungen, mit 1 % Gelatine als vorgegebenem Proteinsubstrat. In in vitro-Versuchen verglichen wir unter identischen Bedingungen zwei Gruppen proteolytischer Aktivitäten: die neutralen und basischen wasserlöslichen und die sauren, detergenzlöslichen. Die aktivsten Proteasen waren saure Proteasen auf Drohnenpuppen, die im Frühling gesammelt worden waren (Abb. 2), neutrale und basische Proteasen auf adulten Drohnen im Sommer (Abb. 3), neutrale auf adulten Königinnen im Herbst, sowie alle Proteasentypen auf Königinnenpuppen im Frühjahr (Abb. 4 und Abb. 2). Die geringsten Proteaseaktivitäten fanden wir auf Arbeiterinnen im Frühjar (Abb. 2) und auf Drohnen im Herbst (Abb. 4). In allen Fällen waren die Aktivitäten auf Puppen und Imagines höher als auf den anderen Stadien. Im zymographischen Vergleich in Gelen mit Gelatine zeigten sich einige Unterschiede. Die schärfsten Banden mit der höchsten Aktivität fanden wir für neutrale und basische Werte auf Königinnen in allen Jahreszeiten. Die verschwommensten Banden waren für neutrale und basische Werte auf Drohnen in allen Jahreszeiten zu verzeichnen. Bei Arbeiterinnenproben erhielten wir für alle Jahreszeiten sowohl klare als auch verschwommen Banden. Letzteres steht in Übereinstimmung mit den niedrigen Proteaseaktivitäten, die wir für Arbeiterinnen in den in vitro-Versuchen gefunden hatten. Vergleichbar hohe Werte für Proteaseinhibitoren fanden wir bei Drohnen im Sommer (Abb. 6) und bei adulten Königinnen im Herbst (Abb. 7).

中文翻译：

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蜂王、工蜂和雄蜂的体表蛋白水解系统概况：蛋白酶及其天然抑制剂的个体发生和季节性变化

我们描述了蜜蜂 (Apis mellifera) 中蛋白酶和蛋白酶抑制剂活性模式在个体发育过程中如何随季节变化以及与种姓和性别的关系。用水和洗涤剂提取体表，然后进行蛋白水解活性和蛋白酶抑制剂水平的体外分析，以及聚丙烯酰胺凝胶中提取物的电泳分离。在体外实验中，我们比较了两组可检测的蛋白水解活性：中性和碱性水溶性与酸性洗涤剂可溶性。最活跃的蛋白酶似乎是酸性蛋白酶，并在春季在雄蜂蛹上检测到。电泳分离中最明显和最活跃的蛋白酶带是在所有季节对蜂王进行中性和碱性活性的那些。从所有季节的工人样本中获得了体外蛋白酶抑制剂活性的最高水平。酶学性质表明提取物中存在所有催化类型的蛋白酶，但活性水平不同，具体取决于 pH 值：pH 2.5 的天冬酰胺和半胱氨酸蛋白酶，pH 7.0 的半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，以及 pH 11.5 的丝氨酸蛋白酶.ZusammenfassungBei verschiedenen Organismen、einschliesslich Schaben、Amphibien und Menschen、wurde bereits eine beschränkte Anzahl an Proteasen und/oder Proteaseinhibitoren auf der Körperoberfläche identifiziert。Dabei sind die Unterschiede innerhalb der Invertebraten und im Vergleich mit Vertebraten nur relativ gering。Untersuchungen basierend auf dem Genom der Honigbienen weisen bereits auf eine bestimmte Anzahl neuer Proteine，einschliesslich Kutikulaproteinen, hin, die auch Proteasen umfassen könnten。Ziel dieser Studie war die Beschreibung der Muster, der in vitro Aktivität und der Zymogramme der Proteasen der Körperoberfläche und ihrer natürlichen Inhibitoren im Verlauf der Ontogenese der Honigbiene (Apis mellifera)。Dabei wurden auch Kasten- und Saisonunterschiede in Betracht gezogen.Adulte Honigbienen wurden entweder am Stockeingang abgefangen (Arbeiterinnen) oder aus dem Volk entommen (Königinnen und Drohnen)。Puppen, Larven 和 Eier wurden aus Brutwaben gewonnen。Larven der ersten drei Larvenstadien wurden als „kleine Larven“ und die des vierten und fünften Larvenstadiums als „grosse Larven“ gepoolt。Alle Proben wurden mit destilliertem Wasser abgewaschen, um Verunreinigungen und nicht festhaftende Mikroorganismen zu entfernen。Anschliessend wurde mittels feuchter Baumwollstäbchen die Körperoberfläche abgewaschen。Aus den Baumwollstäbchen wurden die biologischen Proben ausgepresst。Für eine zweite Waschung wurde destilliertes Wasser mit 1 % Detergenz verwendet。Allgemeine Proteasenaktivitäten wurden am besten pH mittels Hämoglobin als Substrat bestimmt (Tab. I) In den Extrakten waren alle katalytischen Typen an Proteasen vertreten。贝 pH 2,5 天冬酰胺蛋白酶 (inhibiert durch Pepstatin und DAN) 和半胱氨酸蛋白酶 (inhibiert durch Iodoacetamid und pCMB) ihre höchsten Werte; bei pH 7,0 erreichten die Cysteinproteasen und Metalloproteasen (inhibiert durch o-Phenantrolin) 和 bei pH 11,5 die serinproteasen (inhibiert durch PMSF und STI) die höchsten Aktivitätswerte。Die Bestimmung der allgemeinen Niveaus der Aktivitäten der Proteaseninhibitoren wurde mit Pepsin als Proteasemarker bei saurem pH und mit Trypsin als Markerprotease für中性和基础 pH-Werte durchgeführt。Elektrophoresen 在 10 % Gelen erfolgten bei nichtdenaturierenden Bedingungen，mit 1% 明胶和 vorgegebenem Proteinsubstrat。在体外-Versuchen verglichen wir unter identischen Bedingungen zwei Gruppen proteolytischer Aktivitäten：die中性和basicchen wasserlöslichen und die sauren, detergenzlöslichen。Die aktivsten Proteasen saure Proteasen auf Drohnenpuppen, die im Frühling gesammelt worden waren (Abb. 2),中性和基础 Proteasen auf Adulten im Sommer (Abb. 3),中性 auf Adulten Königinnen im Herbest, im Frühling gesammelt worden waren (Abb. 2) （Abb. 4 和 Abb. 2）。Die geringsten Proteaseaktivitäten fanden wir auf Arbeiterinnen im Frühjar (Abb. 2) 和 auf Drohnen im Herbst (Abb. 4)。在 allen Fällenwaren die Aktivitäten auf Puppen und Imagines höher als auf den anderen Stadien。Im zymographischen Vergleich in Gelen mit Gelatin zeigten sich einige Unterschiede。Die schärfsten Banden mit der höchsten Aktivität fanden wir für中性和基础在 allen Jahreszeiten 中的 Werte auf Königinnen。Die verschwommensten Banden waren für中立和基础Werte auf Drohnen in allen Jahreszeiten zu verzeichnen。Bei Arbeiterinnenproben erhielten wir für alle Jahreszeiten sowohl klare als auch verschwommen Banden。Letzteres steht in Übereinstimmung mit den niedrigen Proteaseaktivitäten, die wir für Arbeiterinnen in den invivo-Versuchen gefunden hatten。