The molecular mechanisms driving specific regulation of neutrophils are not completely understood to date. In order to characterize fundamental granulocyte features on protein level, we analyzed changes in proteome composition as reaction to stress from cell activation processes. For this purpose, we isolated primary granulocytes from equine whole blood through density gradient centrifugation followed by sodium chloride lysis and stimulated cells for 30 min with interleukin-8 (IL8) due to its role as a chemotactic factor for neutrophils. We additionally used phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) and lipopolysaccharide (LPS), which are primarily associated to neutrophil extracellular trap formation and release of reactive oxygen species. From mass spectrometry analysis, we identified a total of 2,032 proteins describing the whole granulocyte proteome, including 245 proteins (12% of identified proteome) newly associated to in vivo expression in primary equine granulocytes (hypothetical proteins). We also found distinct and different changes in protein abundance (ratio ≥ 2) after short stimulation of cells with various stimuli, pointing to rapid and differentiated reaction pattern. IL8 stimulation resulted in increased protein abundance of 58 proteins (3% of proteome), whereas PMA induced changed protein abundance of 207 (10 % of proteome) and LPS of 46 proteins (2% of proteome). Enrichment analyses clearly showed fundamental differences between stimuli, with primary association of IL8 stimulation to processes in immune response, receptor signaling and signal transduction. Top enrichment for PMA on the other hand pointed to vesicle mediated transport and exocytosis. Stimulation with LPS did not result in any significant enrichment. Although we detected 43% overlap of enrichment categories for IL8 and PMA stimulation, indicating that activation of neutrophils with different stimuli partly induces some similar biological processes and pathways, hierarchical clustering showed clear differences in distribution and biological relevance of clusters between the chosen stimuli. Our studies provide novel information on the granulocyte proteome and offer insights into early, differentiated granulocyte reaction to stimuli, which contribute to a better understanding of molecular mechanisms involved in activation and recruitment of neutrophils, through inflammatory stimuli.

中文翻译：

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IL8和PMA触发粒细胞活化过程中不同生物过程的调控。

迄今为止，尚未完全了解驱动中性粒细胞特异性调控的分子机制。为了在蛋白质水平上表征基本的粒细胞特征，我们分析了蛋白质组组成的变化，作为对来自细胞活化过程的应激反应。为此，我们通过密度梯度离心法从马全血中分离出原代粒细胞，然后进行氯化钠裂解，并用白介素8（IL8）刺激细胞30分钟，因为它是嗜中性粒细胞的趋化因子。我们还使用了佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-醋酸酯（PMA）和脂多糖（LPS），它们主要与嗜中性白细胞胞外陷阱的形成和活性氧的释放有关。通过质谱分析，我们总共确定了2个 032个蛋白质描述了整个粒细胞蛋白质组，其中包括245个蛋白质（占已鉴定蛋白质组的12％），这些蛋白质与初级马粒细胞的体内表达新相关（假设蛋白质）。在短时间刺激各种刺激的细胞后，我们还发现了蛋白质丰度的不同变化（比率≥2），这表明反应模式迅速而分化。IL8刺激导致58种蛋白质的蛋白质丰度增加（占蛋白质组的3％），而PMA引起207种蛋白质的改变（蛋白质组的10％）和46种蛋白质的LPS（蛋白质组的2％）的变化。富集分析清楚地显示出刺激之间的根本差异，IL8刺激与免疫应答，受体信号传导和信号转导过程之间存在主要关联。另一方面，PMA的最高富集指向囊泡介导的转运和胞吐作用。用LPS刺激不会导致任何明显的富集。尽管我们检测到IL8和PMA刺激的富集类别有43％的重叠，这表明具有不同刺激的嗜中性粒细胞的激活部分地诱导了一些相似的生物学过程和途径，但分层聚类显示所选刺激之间簇的分布和生物学相关性存在明显差异。我们的研究提供了有关粒细胞蛋白质组的新信息，并提供了对早期，分化的粒细胞对刺激的反应的见解，这些作用有助于通过炎症刺激更好地了解中性粒细胞的激活和募集所涉及的分子机制。用LPS刺激不会导致任何明显的富集。尽管我们检测到IL8和PMA刺激的富集类别有43％的重叠，这表明具有不同刺激的嗜中性粒细胞的激活部分地诱导了一些相似的生物学过程和途径，但分层聚类显示所选刺激之间簇的分布和生物学相关性存在明显差异。我们的研究提供了有关粒细胞蛋白质组的新信息，并提供了对早期，分化的粒细胞对刺激的反应的见解，这些作用有助于通过炎症刺激更好地了解中性粒细胞的激活和募集所涉及的分子机制。用LPS刺激不会导致任何明显的富集。尽管我们检测到IL8和PMA刺激的富集类别有43％的重叠，这表明具有不同刺激的嗜中性粒细胞的激活部分地诱导了一些相似的生物学过程和途径，但分层聚类显示所选刺激之间簇的分布和生物学相关性存在明显差异。我们的研究提供了有关粒细胞蛋白质组的新信息，并提供了对早期，分化的粒细胞对刺激的反应的见解，这些作用有助于通过炎症刺激更好地了解中性粒细胞的激活和募集涉及的分子机制。这表明具有不同刺激的嗜中性粒细胞的激活部分地诱导了一些相似的生物学过程和途径，分级聚类表明所选刺激之间聚类的分布和生物学相关性存在明显差异。我们的研究提供了有关粒细胞蛋白质组的新信息，并提供了对早期，分化的粒细胞对刺激的反应的见解，这些作用有助于通过炎症刺激更好地了解中性粒细胞的激活和募集所涉及的分子机制。这表明具有不同刺激的嗜中性粒细胞的激活部分地诱导了一些相似的生物学过程和途径，分级聚类表明所选刺激之间聚类的分布和生物学相关性存在明显差异。我们的研究提供了有关粒细胞蛋白质组的新信息，并提供了对早期，分化的粒细胞对刺激的反应的见解，这些作用有助于通过炎症刺激更好地了解中性粒细胞的激活和募集所涉及的分子机制。