Looking for new ene-reductases with uncovered features beneficial for biotechnological applications, by mining genomes of photosynthetic extremophile organisms, we identified two new Old Yellow Enzyme homologues: CtOYE, deriving from the cyanobacterium Chroococcidiopsis thermalis, and GsOYE, from the alga Galdieria sulphuraria. Both enzymes were produced and purified with very good yields and displayed catalytic activity on a broad substrate spectrum by reducing α,β-unsaturated ketones, aldehydes, maleimides and nitroalkenes with good to excellent stereoselectivity. Both enzymes prefer NADPH but demonstrate a good acceptance of NADH as cofactor. CtOYE and GsOYE represent robust biocatalysts showing high thermostability, a wide range of pH optimum and good co-solvent tolerance. High resolution X-ray crystal structures of both enzymes have been determined, revealing conserved features of the classical OYE subfamily as well as unique properties, such as a very long loop entering the active site or an additional C-terminal alpha helix in GsOYE. Not surprisingly, the active site of CtOYE and GsOYE structures revealed high affinity toward anions caught from the mother liquor and trapped in the anion hole where electron-withdrawing groups such as carbonyl group are engaged. Ligands (para-hydroxybenzaldehyde and 2-methyl-cyclopenten-1-one) added on purpose to study complexes of GsOYE were detected in the enzyme catalytic cavity, stacking on top of the FMN cofactor, and support the key role of conserved residues and FMN cofactor in the catalysis.

中文翻译：

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来自光合极端微生物的两种新的烯还原酶扩大了旧的黄色酶的种类：CtOYE和GsOYE。

通过挖掘光合极端微生物的基因组，寻找具有未被发现的有利于生物技术应用的特征的新的烯还原酶，我们鉴定了两个新的旧黄色酶同系物：CtOYE（源自蓝藻嗜热球菌（Chroococcidiopsiss）和GsOYE源自于藻类加硫酶）。两种酶的生产和纯化均具有很高的收率，并且通过还原α，β-不饱和酮，醛，马来酰亚胺和硝基烯烃，具有良好的至优异的立体选择性，在宽的底物谱上显示了催化活性。两种酶均偏爱NADPH，但显示出NADH作为辅助因子的良好接受性。CtOYE和GsOYE代表了坚固的生物催化剂，显示出高的热稳定性，广泛的pH最佳范围和良好的共溶剂耐受性。已经确定了这两种酶的高分辨率X射线晶体结构，揭示了经典OYE亚科的保守特征以及独特的特性，例如非常长的环进入活性位点或GsOYE中的其他C端α螺旋。毫不奇怪，CtOYE和GsOYE结构的活性位点显示出对从母液中捕获并捕获在阴离子孔中的负离子的高度亲和力，阴离子孔中吸收了吸电子基团（例如羰基）。在酶催化腔中检测到专门用于研究GsOYE配合物的配体（对羟基苯甲醛和2-甲基-环戊烯-1-酮），堆积在FMN辅因子的顶部，并支持保守残基和FMN的关键作用催化中的辅助因子。揭示了经典OYE家族的保守特征以及独特的特性，例如进入活性位点的长环或GsOYE中的一个额外的C末端α螺旋。毫不奇怪，CtOYE和GsOYE结构的活性位点显示出对从母液中捕获并捕获在阴离子孔中的负离子的高度亲和力，其中阴离子吸收孔与羰基等吸电子基团结合。在酶催化腔中检测到专门用于研究GsOYE配合物的配体（对羟基苯甲醛和2-甲基-环戊烯-1-酮），堆积在FMN辅因子的顶部，并支持保守残基和FMN的关键作用催化中的辅助因子。揭示了经典OYE家族的保守特征以及独特的特性，例如进入活性位点的长环或GsOYE中的一个额外的C末端α螺旋。毫不奇怪，CtOYE和GsOYE结构的活性位点显示出对从母液中捕获并捕获在阴离子孔中的负离子的高度亲和力，其中阴离子吸收孔与羰基等吸电子基团结合。在酶催化腔中检测到专门用于研究GsOYE配合物的配体（对羟基苯甲醛和2-甲基-环戊烯-1-酮），堆积在FMN辅因子的顶部，并支持保守残基和FMN的关键作用催化中的辅助因子。CtOYE和GsOYE结构的活性位点显示出对从母液捕获并捕获在阴离子孔中的负离子的高度亲和力，其中阴离子吸收孔与羰基等吸电子基团结合。在酶催化腔中检测到专门用于研究GsOYE配合物的配体（对羟基苯甲醛和2-甲基-环戊烯-1-酮），堆积在FMN辅因子的顶部，并支持保守残基和FMN的关键作用催化中的辅助因子。CtOYE和GsOYE结构的活性位点显示出对从母液捕获并捕获在阴离子孔中的负离子的高度亲和力，其中阴离子吸收孔与羰基等吸电子基团结合。在酶催化腔中检测到专门用于研究GsOYE配合物的配体（对羟基苯甲醛和2-甲基-环戊烯-1-酮），堆积在FMN辅因子的顶部，并支持保守残基和FMN的关键作用催化中的辅助因子。