Quantification real-time PCR (qRT-PCR) is a common method in analysis of gene expression, but the stable reference genes for the normalization analysis have not been appreciated before identifying expression pattern of genes in teleost fishes. In this study, we selected eight candidate reference genes (18S, Actin, EF-1α, 40S, B2M, TUBA, UBCE and GAPDH) basing on transcriptome analysis and the traditional housekeeping genes, and analyzed the stability of the reference genes in spleen, head kidney and head kidney leukocytes (HKL) after pathogen challenge in Schizothorax prenanti (S. prenanti). Three common programs (geNorm, NormFinder and Bestkeeper) were used to evaluate the stability of the candidate reference genes. Two reference genes, Actin and EF-1α presented higher stability, while 18S and GAPDH were the lower stable genes, both in in vitro and in vivo. An important immune gene, toll-like receptor 22a (TLR22a), was selected to validate the stability of the proposed reference genes (Actin and EF-1α) across different experiment treatments. The results reveal that Actin and EF-1α are quite suitable reference genes for the normalization analysis. Otherwise, using the most stable gene Actin to validate the reliable of transcriptome data showed the high correlation between the fold change of transcriptome data and qRT-PCR data. In conclusion, our study not only acquired the suitable reference gene for the qRT-PCR assay under specific experiment condition, but also provided a comprehensive method to evaluate and validate the reference gene based on transcriptome analysis in teleost fishes.

中文翻译：

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基于转录组的评估和验证合适的看家基因，用于在特定实验条件下对硬骨鱼进行定量实时PCR。

实时定量PCR（qRT-PCR）是分析基因表达的一种常用方法，但是在鉴定硬骨鱼的基因表达模式之前，尚未认识到用于标准化分析的稳定参考基因。在这项研究中，我们根据转录组分析和传统的看家基因，选择了8个候选参考基因（18S，肌动蛋白，EF-1α，40S，B2M，TUBA，UBCE和GAPDH），并分析了这些参考基因在脾脏中的稳定性，病原体在Schizothorax prenanti（S. prenanti）中攻击后的头肾和头肾白细胞（HKL）。三个通用程序（geNorm，NormFinder和Bestkeeper）用于评估候选参考基因的稳定性。肌动蛋白和EF-1α这两个参考基因具有较高的稳定性，而18S和GAPDH是较低的稳定基因，无论是在体内还是体外。选择了一种重要的免疫基因，即Toll样受体22a（TLR22a），以验证提议的参考基因（肌动蛋白和EF-1α）在不同实验处理中的稳定性。结果显示肌动蛋白和EF-1α是非常适合标准化分析的参考基因。否则，使用最稳定的基因肌动蛋白来验证转录组数据的可靠性，表明转录组数据的倍数变化与qRT-PCR数据之间存在高度相关性。总之，我们的研究不仅为特定实验条件下的qRT-PCR检测获得了合适的参考基因，而且为基于硬骨鱼类的转录组分析提供了一种全面的方法来评估和验证参考基因。选择该基因来验证提议的参考基因（肌动蛋白和EF-1α）在不同实验处理中的稳定性。结果显示肌动蛋白和EF-1α是非常适合标准化分析的参考基因。否则，使用最稳定的基因肌动蛋白来验证转录组数据的可靠性，表明转录组数据的倍数变化与qRT-PCR数据之间存在高度相关性。总之，我们的研究不仅为特定实验条件下的qRT-PCR检测获得了合适的参考基因，而且为基于硬骨鱼类的转录组分析提供了一种全面的方法来评估和验证参考基因。选择该基因来验证提议的参考基因（肌动蛋白和EF-1α）在不同实验处理中的稳定性。结果显示肌动蛋白和EF-1α是非常适合标准化分析的参考基因。否则，使用最稳定的基因肌动蛋白来验证转录组数据的可靠性，表明转录组数据的倍数变化与qRT-PCR数据之间存在高度相关性。总之，我们的研究不仅为特定实验条件下的qRT-PCR检测获得了合适的参考基因，而且为基于硬骨鱼类的转录组分析提供了一种全面的方法来评估和验证参考基因。结果显示肌动蛋白和EF-1α是非常适合标准化分析的参考基因。否则，使用最稳定的基因肌动蛋白来验证转录组数据的可靠性，表明转录组数据的倍数变化与qRT-PCR数据之间存在高度相关性。总之，我们的研究不仅为特定实验条件下的qRT-PCR检测获得了合适的参考基因，而且为基于硬骨鱼类的转录组分析提供了一种全面的方法来评估和验证参考基因。结果表明肌动蛋白和EF-1α是非常适合标准化分析的参考基因。否则，使用最稳定的基因肌动蛋白来验证转录组数据的可靠性，表明转录组数据的倍数变化与qRT-PCR数据之间存在高度相关性。总之，我们的研究不仅为特定实验条件下的qRT-PCR检测获得了合适的参考基因，而且为基于硬骨鱼类的转录组分析提供了一种全面的方法来评估和验证参考基因。