The elution behavior of bivalent bispecific antibodies (BiSAb) comprising an immunoglobulin G framework genetically fused to a pair of single chain variable fragments (scFvs) was studied on hydrophobic interaction chromatography (HIC) columns using ammonium sulfate gradients. Each of the BiSAb molecules studied exhibited a three-peak elution behavior regardless of the location of scFv attachment to the framework IgG. Collecting and re-injecting each of the isolated peaks and eluting with the same gradient resulted in the same three-peak profile indicating that the behavior is reversible. Analogous behavior was observed for HIC resins with different functional ligands, matrix structures, and particle sizes. Residence time, operating temperature, and hold time were shown to affect the elution behavior. While three peaks were obtained at short residence times and room temperature, residence times longer than about 27 min or operating at 45 °C resulted in a single merged peak indicating that the underlying mechanism occurs on time scales comparable to that of chromatographic separation. Holding the protein on the resins prior to elution enriched the late eluting peak indicating that multiple binding states formed on the chromatographic surface are responsible for this behavior. Tryptophan auto-fluorescence measurements show that stronger binding forms have increased solvent exposure indicating that surface-catalyzed conformational changes play a role. A model was developed to describe the interplay of chromatographic separation and slow conformational changes.

中文翻译：

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二价双特异性抗体在疏水相互作用色谱柱上的色谱行为。

使用硫酸铵梯度在疏水相互作用色谱（HIC）色谱柱上研究了包含与一对单链可变片段（scFvs）遗传融合的免疫球蛋白G框架的二价双特异性抗体（BiSAb）的洗脱行为。所研究的每个BiSAb分子均表现出三峰洗脱行为，而与scFv与框架IgG附着的位置无关。收集并重新注入每个孤立的峰，并以相同的梯度洗脱，得到相同的三峰轮廓，表明该行为是可逆的。对于具有不同功能配体，基质结构和粒径的HIC树脂，观察到了类似的行为。显示了停留时间，操作温度和保持时间会影响洗脱行为。尽管在短的停留时间和室温下获得了三个峰，但停留时间超过约27分钟或在45°C下运行时，会得到一个合并的峰，这表明潜在的机理发生在与色谱分离相当的时间范围内。洗脱前将蛋白质保留在树脂上会富集后期洗脱峰，这表明在色谱表面形成的多个结合状态是造成这种现象的原因。色氨酸自发荧光测量表明，较强的结合形式具有增加的溶剂暴露，表明表面催化的构象变化起作用。开发了一个模型来描述色谱分离和缓慢构象变化之间的相互作用。停留时间超过约27分钟或在45°C下运行时，会产生一个合并的峰，这表明潜在的机理在与色谱分离相当的时间范围内发生。洗脱前将蛋白质保留在树脂上会富集晚期洗脱峰，这表明在色谱表面形成的多个结合状态是造成这种现象的原因。色氨酸自发荧光测量表明，较强的结合形式具有增加的溶剂暴露，表明表面催化的构象变化起作用。开发了一个模型来描述色谱分离和缓慢构象变化之间的相互作用。停留时间超过约27分钟或在45°C下运行时，会产生一个合并的峰，这表明潜在的机理在与色谱分离相当的时间范围内发生。洗脱前将蛋白质保留在树脂上会富集后期洗脱峰，这表明在色谱表面形成的多个结合状态是造成这种现象的原因。色氨酸自发荧光测量表明，较强的结合形式具有增加的溶剂暴露，表明表面催化的构象变化起作用。开发了一个模型来描述色谱分离和缓慢构象变化之间的相互作用。洗脱前将蛋白质保留在树脂上会富集后期洗脱峰，这表明在色谱表面形成的多个结合状态是造成这种现象的原因。色氨酸自发荧光测量表明，较强的结合形式具有增加的溶剂暴露，表明表面催化的构象变化起作用。开发了一个模型来描述色谱分离和缓慢构象变化之间的相互作用。洗脱前将蛋白质保留在树脂上会富集后期洗脱峰，这表明在色谱表面形成的多个结合状态是造成这种现象的原因。色氨酸自发荧光测量表明，较强的结合形式具有增加的溶剂暴露，表明表面催化的构象变化起作用。开发了一个模型来描述色谱分离和缓慢构象变化之间的相互作用。