Arginine-rich motifs (ARMs) bind RNA structures with high affinity and specificity, and the human immunodeficiency virus (HIV) exploits ARM-RNA interactions to regulate its lifecycle. The expression of HIV structural genes relies on recognition between the ARM of its Rev protein and its primary binding site, an internal loop in the viral RNA, the Rev-response element region IIB (IIB). Many functional variants of the Rev ARM-IIB interaction have been discovered, yet how easily it can evolve new specificities is poorly explored. A double mutant of Rev ARM, R35G-N40 V, uses an unknown strategy to recognize IIB. Here, isothermal titration calorimetry and gel shift assays show that the R35G-N40V-IIB interaction has high affinity and specificity in vitro and a larger unfavorable entropy change upon binding than that of wild-type Rev ARM-IIB. In stark contrast with the critical dependence of wild-type Rev on Arg35, Arg39, Asn40, and Arg44, mutational profiling shows R35G-N40V is highly mutable at positions 40 and 44 and dependent on Gly35, Arg38, Arg39, Arg42, and Arg43. Affinity measurements in vitro and reporter assay measurements in vivo are consistent with the wild-type Rev ARM and R35G-N40V maintaining their recognition strategies when binding IIB mutants specific to wild-type Rev ARM and R35G-N40V, respectively. Some single amino acid mutants of wild-type Rev ARM and R35G-N40V have enhanced specificity, recognizing mutant IIBs yet not wild-type IIB. These results provide another example of viral ARM-RNA interactions evolving new specificities with few mutations, consistent with neutral theories of evolution.

中文翻译：

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HIV Rev富含精氨酸基序-RRE IIB相互作用的特异性突变体。

富含精氨酸的基序 (ARM) 以高亲和力和特异性结合 RNA 结构，人类免疫缺陷病毒 (HIV) 利用 ARM-RNA 相互作用来调节其生命周期。HIV 结构基因的表达依赖于其 Rev 蛋白的 ARM 与其主要结合位点、病毒 RNA 的内部环、Rev 反应元件区域 IIB (IIB) 之间的识别。已经发现了 Rev ARM-IIB 相互作用的许多功能变体，但对它进化新特性的难易程度却缺乏探索。Rev ARM 的双突变体 R35G-N40 V 使用未知策略识别 IIB。在这里，等温滴定量热法和凝胶位移测定表明，R35G-N40V-IIB 相互作用在体外具有高亲和力和特异性，并且在结合时比野生型 Rev ARM-IIB 具有更大的不利熵变化。与野生型 Rev 对 Arg35、Arg39、Asn40 和 Arg44 的严重依赖性形成鲜明对比的是，突变分析显示 R35G-N40V 在位置 40 和 44 处高度可变，并且依赖于 Gly35、Arg38、Arg39、Arg42 和 Arg43。体外亲和力测量和体内报告基因测定测量与野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 一致，当结合分别对野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 具有特异性的 IIB 突变体时，它们保持其识别策略。野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 的一些单氨基酸突变体具有增强的特异性，识别突变型 IIB 但不能识别野生型 IIB。这些结果提供了病毒 ARM-RNA 相互作用进化出具有很少突变的新特异性的另一个例子，这与进化的中性理论一致。Asn40 和 Arg44，突变分析显示 R35G-N40V 在位置 40 和 44 处高度可变，并且依赖于 Gly35、Arg38、Arg39、Arg42 和 Arg43。体外亲和力测量和体内报告基因测定测量与野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 一致，当结合分别对野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 具有特异性的 IIB 突变体时，它们保持其识别策略。野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 的一些单氨基酸突变体具有增强的特异性，识别突变型 IIB 但不能识别野生型 IIB。这些结果提供了病毒 ARM-RNA 相互作用进化出具有很少突变的新特异性的另一个例子，这与进化的中性理论一致。Asn40 和 Arg44，突变谱显示 R35G-N40V 在位置 40 和 44 处高度可变，并且依赖于 Gly35、Arg38、Arg39、Arg42 和 Arg43。体外亲和力测量和体内报告基因测定测量与野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 一致，当结合分别对野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 具有特异性的 IIB 突变体时，它们保持其识别策略。野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 的一些单氨基酸突变体具有增强的特异性，识别突变型 IIB 但不能识别野生型 IIB。这些结果提供了病毒 ARM-RNA 相互作用进化出具有很少突变的新特异性的另一个例子，这与进化的中性理论一致。体外亲和力测量和体内报告基因测定测量与野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 一致，当结合分别对野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 具有特异性的 IIB 突变体时，它们保持其识别策略。野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 的一些单氨基酸突变体具有增强的特异性，识别突变型 IIB 但不能识别野生型 IIB。这些结果提供了病毒 ARM-RNA 相互作用进化出具有很少突变的新特异性的另一个例子，这与进化的中性理论一致。体外亲和力测量和体内报告基因测定测量与野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 一致，当结合分别对野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 具有特异性的 IIB 突变体时，它们保持其识别策略。野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 的一些单氨基酸突变体具有增强的特异性，识别突变型 IIB 但不能识别野生型 IIB。这些结果提供了病毒 ARM-RNA 相互作用进化出具有很少突变的新特异性的另一个例子，这与进化的中性理论一致。野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 的一些单氨基酸突变体具有增强的特异性，识别突变型 IIB 但不能识别野生型 IIB。这些结果提供了病毒 ARM-RNA 相互作用进化出具有很少突变的新特异性的另一个例子，这与进化的中性理论一致。野生型 Rev ARM 和 R35G-N40V 的一些单氨基酸突变体具有增强的特异性，识别突变型 IIB 但不能识别野生型 IIB。这些结果提供了病毒 ARM-RNA 相互作用进化出具有很少突变的新特异性的另一个例子，这与进化的中性理论一致。