Two kinds of Kunitz-type protease inhibitors, AKPI1 and AKPI2, were purified from Apios americana tubers by four steps of column chromatographies and their cDNA cloning was performed. AKPI1 cDNA consist of 809 nucleotides, and the matured protein had 190 amino acids with 20,594 Da. AKPI2 cDNA consist of 794 nucleotides, and the matured protein had 177 amino acids with 19,336 Da. P1 site of AKPI2 was Leu88, suggested the target enzyme was chymotrypsin. On the other hand, Gly85-Ile86-Ser87 was positioned around P1 site of AKTI1. Sequence analysis suggested that two forms (single-chain and two-chain form) of AKPI2 protein were present in the tubers. Recombinant AKPI2 expressed by E.coli system showed inhibitory activity toward serine proteases and heat stability. The Ki values toward chymotrypsin and trypsin were 4 × 10-7 M and 6 × 10-6 M, respectively.Abbreviations: AAL: Apios americana lectin; AATI: Apios americana Bowman-Birk type trypsin inhibitor; ACE: angiotensin-converting enzyme; IPTG: isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside; Ki: inhibition constant; KPIs: Kunitz-type protease inhibitors; L-BAPA: Benzoyl-L-arginine p-nitroanilide monohydrochloride; L-BTPA: Benzoyl-L-tyrosine p-nitroanilide; PFLNA: Pyr-Phe-Leu-p-nitroanilide; RP-HPLC: reverse-phase high-performance liquid chromatography; RT-PCR: reverse transcription-polymerase chain reaction; SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SLIC: sequence and ligation independent cloning; STANA: N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide; SHR: spontaneously hypertensive rats; TFA: trifluoroacetic acid; UTR: untranslated region.

中文翻译：

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美洲块茎中Kunitz型蛋白酶抑制剂的纯化，cDNA克隆和表征。

通过四个步骤的柱色谱法从美洲马铃薯中纯化出两种Kunitz型蛋白酶抑制剂AKPI1和AKPI2，并进行了cDNA克隆。AKPI1 cDNA由809个核苷酸组成，成熟的蛋白质具有190个氨基酸，含20594 Da。AKPI2 cDNA由794个核苷酸组成，成熟的蛋白质具有177个氨基酸，含19,336 Da。AKPI2的P1位点是Leu88，表明目标酶是胰凝乳蛋白酶。另一方面，Gly85-Ile86-Ser87位于AKTI1的P1位点附近。序列分析表明，块茎中存在两种形式的AKPI2蛋白（单链和双链形式）。E.coli系统表达的重组AKPI2对丝氨酸蛋白酶具有抑制活性和热稳定性。胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶的Ki值分别为4×10-7 M和6×10-6 M，缩写：AAL：美国Apios凝集素；AATI：美国Apios Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂；ACE：血管紧张素转换酶；IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；Ki：抑制常数；KPI：Kunitz型蛋白酶抑制剂；L-BAPA：苯甲酰基-L-精氨酸对硝基苯胺一盐酸盐；L-BTPA：苯甲酰基-L-酪氨酸对硝基苯胺；PFLNA：Pyr-Phe-Leu-对硝基苯胺；RP-HPLC：反相高效液相色谱；RT-PCR：逆转录聚合酶链反应；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。SLIC：独立于序列和连接的克隆；STANA：N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺；SHR：自发性高血压大鼠；TFA：三氟乙酸； m / z。UTR：未翻译的区域。Apios americana Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂；ACE：血管紧张素转换酶；IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；Ki：抑制常数；KPI：Kunitz型蛋白酶抑制剂；L-BAPA：苯甲酰基-L-精氨酸对硝基苯胺一盐酸盐；L-BTPA：苯甲酰基-L-酪氨酸对硝基苯胺；PFLNA：Pyr-Phe-Leu-对硝基苯胺；RP-HPLC：反相高效液相色谱；RT-PCR：逆转录聚合酶链反应；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。SLIC：独立于序列和连接的克隆；STANA：N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺；SHR：自发性高血压大鼠；TFA：三氟乙酸； m / z。UTR：未翻译的区域。Apios americana Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂；ACE：血管紧张素转换酶；IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷；Ki：抑制常数；KPI：Kunitz型蛋白酶抑制剂；L-BAPA：苯甲酰基-L-精氨酸对硝基苯胺一盐酸盐；L-BTPA：苯甲酰基-L-酪氨酸对硝基苯胺；PFLNA：Pyr-Phe-Leu-对硝基苯胺；RP-HPLC：反相高效液相色谱；RT-PCR：逆转录聚合酶链反应；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。SLIC：独立于序列和连接的克隆；STANA：N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺；SHR：自发性高血压大鼠；TFA：三氟乙酸； m / z。UTR：未翻译的区域。Kunitz型蛋白酶抑制剂；L-BAPA：苯甲酰基-L-精氨酸对硝基苯胺一盐酸盐；L-BTPA：苯甲酰基-L-酪氨酸对硝基苯胺；PFLNA：Pyr-Phe-Leu-对硝基苯胺；RP-HPLC：反相高效液相色谱；RT-PCR：逆转录聚合酶链反应；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。SLIC：独立于序列和连接的克隆；STANA：N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺；SHR：自发性高血压大鼠；TFA：三氟乙酸； m / z。UTR：未翻译的区域。Kunitz型蛋白酶抑制剂；L-BAPA：苯甲酰基-L-精氨酸对硝基苯胺一盐酸盐；L-BTPA：苯甲酰基-L-酪氨酸对硝基苯胺；PFLNA：Pyr-Phe-Leu-对硝基苯胺；RP-HPLC：反相高效液相色谱；RT-PCR：逆转录聚合酶链反应；SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。SLIC：独立于序列和连接的克隆；STANA：N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺；SHR：自发性高血压大鼠；TFA：三氟乙酸； m / z。UTR：未翻译的区域。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；SLIC：独立于序列和连接的克隆；STANA：N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺；SHR：自发性高血压大鼠；TFA：三氟乙酸； m / z。UTR：未翻译的区域。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳；SLIC：独立于序列和连接的克隆；STANA：N-琥珀酰-Ala-Ala-Ala-对硝基苯胺；SHR：自发性高血压大鼠；TFA：三氟乙酸； m / z。UTR：未翻译的区域。