One of the potential mechanisms underlying acquired resistance to toceranib in canine mast cell tumor (MCT) is the emergence of a secondary mutation in the KIT gene. Here, genetic alterations of KIT during clonal expansion and subsequent acquisition of resistance to toceranib were investigated in the toceranib-susceptible canine MCT cell line VI-MC, which carries a KIT-activating mutation resulting in a predicted p.(Asn508Ile) amino acid change in the receptor tyrosine kinase protein KIT. Two sublines were cloned from VI-MC and toceranib-resistant sublines then were established by continuous exposure to toceranib. The mutation status of KIT in parental VI-MC and its sublines was investigated using next-generation sequencing (NGS). Additionally, effects of secondary mutations on toceranib sensitivity in p.(Asn508Ile)-mutant KIT were examined. KIT secondary mutations, including those encoding p.(Asn679Lys)-, p.(Asp819Val)-, and p.(Asp819Gly)-mutant KIT, that confer toceranib insensitivity to p.(Asn508Ile)-mutant KIT emerged only in toceranib-resistant VI-MCs. These mutations were not detected by NGS in the parental VI-MC line or in the toceranib-naive cloned VI-MCs, although the parental line and sublines exhibited genetic heterogeneity in KIT that may have been caused by genetic evolution during clonal expansion. VI-MC clones with these secondary mutations in KIT appear to have arisen from subclones during treatment with toceranib rather than being pre-existing. However, further study using a higher resolution technique will be needed to confirm the developmental mechanism of KIT secondary mutation in canine MCT cells with acquired resistance to toceranib.

中文翻译：

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犬肥大细胞肿瘤细胞系中克隆扩增和随后获得的对甲草胺抗性期间KIT的遗传改变。

犬肥大细胞肿瘤（MCT）中对甲草胺获得性抗性的潜在潜在机制之一是KIT基因中出现了第二个突变。在这里，在对耐库拉尼布的犬MCT细胞系VI-MC中研究了克隆扩增和随后对耐库拉尼布的耐药性期间KIT的遗传变化，该细胞系发生KIT激活突变，导致预测的p。（Asn508Ile）氨基酸变化受体中的酪氨酸激酶蛋白KIT。从VI-MC中克隆了两个亚系，然后通过持续暴露于toceranib建立了耐toceranib的亚系。使用下一代测序（NGS）研究了亲本VI-MC及其亚系中KIT的突变状态。另外，还研究了继发突变对p。（Asn508Ile）突变型KIT的甲草胺敏感性的影响。KIT二级突变，包括编码p。（Asn679Lys）-，p。（Asp819Val）-和p。（Asp819Gly）-突变型KIT的突变，这些突变导致对c。（Asn508Ile）-突变型KIT的耐ceranib不敏感，仅在耐toceranib的情况下出现VI-MC。尽管亲本品系和亚系在KIT中表现出遗传异质性，这可能是由克隆扩增过程中的遗传进化引起的，但在亲本VI-MC品系或未使用toceranib的克隆VI-MC中，NGS并未检测到这些突变。在KIT中具有这些继发突变的VI-MC克隆似乎是在用香兰素治疗期间源自亚克隆，而不是预先存在的。然而，将需要进一步的研究，以更高分辨率的技术，以确认具有对库拉尼布的抗性的犬MCT细胞中KIT继发突变的发展机制。包括编码p。（Asn679Lys）-，p。（Asp819Val）-和p。（Asp819Gly）-突变KIT的那些，使得对p。（Asn508Ile）-突变KIT的耐ceranib不敏感仅出现在耐耐库拉尼布的VI-MC中。尽管亲本品系和亚系在KIT中表现出遗传异质性，这可能是由克隆扩增过程中的遗传进化引起的，但在亲本VI-MC品系或未使用toceranib的克隆VI-MC中，NGS并未检测到这些突变。在KIT中具有这些继发突变的VI-MC克隆似乎是在用香兰素治疗期间源自亚克隆，而不是预先存在的。但是，将需要进一步的研究来使用更高分辨率的技术，以证实具有对库拉尼布的抗性的犬MCT细胞中KIT继发突变的发生机制。包括编码p。（Asn679Lys）-，p。（Asp819Val）-和p。（Asp819Gly）-突变KIT的那些，使得对p。（Asn508Ile）-突变KIT的耐ceranib不敏感仅出现在耐耐库拉尼布的VI-MC中。尽管亲本品系和亚系在KIT中表现出遗传异质性，这可能是由克隆扩增过程中的遗传进化引起的，但在亲本VI-MC品系或未使用toceranib的克隆VI-MC中，NGS并未检测到这些突变。在KIT中具有这些继发突变的VI-MC克隆似乎是在用香兰素治疗期间源自亚克隆，而不是预先存在的。但是，将需要进一步的研究来使用更高分辨率的技术，以证实具有对库拉尼布的抗性的犬MCT细胞中KIT继发突变的发生机制。（asp819Gly）突变型KIT仅对耐阿昔洛宁的VI-MC出现了对p。（Asn508Ile）突变型KIT的耐角虫毒素不敏感性。尽管亲本品系和亚系在KIT中表现出遗传异质性，这可能是由克隆扩增过程中的遗传进化引起的，但在亲本VI-MC品系或未使用toceranib的克隆VI-MC中，NGS并未检测到这些突变。在KIT中具有这些继发突变的VI-MC克隆似乎是在用香兰素治疗期间源自亚克隆，而不是预先存在的。但是，将需要进一步的研究来使用更高分辨率的技术，以证实具有对库拉尼布的抗性的犬MCT细胞中KIT继发突变的发生机制。（asp819Gly）突变型KIT仅对耐阿昔洛宁的VI-MC出现了对p。（Asn508Ile）突变型KIT的耐角虫毒素不敏感性。尽管亲本品系和亚系在KIT中表现出遗传异质性，这可能是由克隆扩增过程中的遗传进化引起的，但在亲本VI-MC品系或未使用toceranib的克隆VI-MC中，NGS并未检测到这些突变。在KIT中具有这些继发突变的VI-MC克隆似乎是在用香兰素治疗期间源自亚克隆，而不是预先存在的。但是，将需要进一步的研究来使用更高分辨率的技术，以证实具有对库拉尼布的抗性的犬MCT细胞中KIT继发突变的发生机制。（Asn508Ile）突变的KIT仅在耐托拉尼布的VI-MC中出现。尽管亲本品系和亚系在KIT中表现出遗传异质性，这可能是由克隆扩增过程中的遗传进化引起的，但在亲本VI-MC品系或未使用toceranib的克隆VI-MC中，NGS并未检测到这些突变。在KIT中具有这些继发突变的VI-MC克隆似乎是在用香兰素治疗期间源自亚克隆，而不是预先存在的。但是，将需要进一步的研究来使用更高分辨率的技术，以证实具有对库拉尼布的抗性的犬MCT细胞中KIT继发突变的发生机制。（Asn508Ile）突变的KIT仅在耐托拉尼布的VI-MC中出现。尽管亲本品系和亚系在KIT中表现出遗传异质性，这可能是由克隆扩增过程中的遗传进化引起的，但在亲本VI-MC品系或未经toceranib克隆的VI-MC中，NGS并未检测到这些突变。在KIT中具有这些继发突变的VI-MC克隆似乎是在用香兰素治疗期间源自亚克隆，而不是预先存在的。但是，将需要进一步的研究来使用更高分辨率的技术，以证实具有对库拉尼布的抗性的犬MCT细胞中KIT继发突变的发生机制。尽管亲本系和子系在KIT中表现出遗传异质性，这可能是克隆扩增过程中的遗传进化所致。在KIT中具有这些继发突变的VI-MC克隆似乎是在用香兰素治疗期间源自亚克隆，而不是预先存在的。但是，将需要进一步的研究来使用更高分辨率的技术，以证实具有对库拉尼布的抗性的犬MCT细胞中KIT继发突变的发生机制。尽管亲本系和子系在KIT中表现出遗传异质性，这可能是克隆扩增过程中的遗传进化所致。在KIT中具有这些继发突变的VI-MC克隆似乎是在用香兰素治疗期间源自亚克隆，而不是预先存在的。但是，将需要进一步的研究来使用更高分辨率的技术，以证实具有对库拉尼布的抗性的犬MCT细胞中KIT继发突变的发生机制。