Antisense oligonucleotide (AON)-mediated exon skipping aimed at restoring the reading frame is a promising therapeutic approach for Duchenne muscular dystrophy that is currently tested in clinical trials. Numerous AONs have been tested in (patient-derived) cultured muscle cells and the mdx mouse model. The main outcome to measure AON efficiency is usually the exon-skipping percentage, though different groups use different methods to assess these percentages. Here, we compare a series of techniques to quantify exon skipping levels in AON-treated mdx mouse muscle. We compared densitometry of RT-PCR products on ethidium bromide-stained agarose gels, primary and nested RT-PCR followed by bioanalyzer analysis and melting curve analysis. The digital array system (Fluidigm) allows absolute quantification of skipped vs non-skipped transcripts and was used as a reference. Digital array results show that 1 ng of mdx gastrocnemius muscle-derived mRNA contains approximately 1100 dystrophin transcripts and that 665 transcripts are sufficient to determine exon-skipping levels. Quantification using bioanalyzer or densitometric analysis of primary PCR products resulted in values close to those obtained with digital array. The use of the same technique allows comparison between different groups working on exon skipping in the mdx mouse model.

中文翻译：

---

杜氏肌营养不良症中抗肌萎缩蛋白 mRNA 和外显子跳跃水平的准确定量。

旨在恢复阅读框的反义寡核苷酸 (AON) 介导的外显子跳跃是一种很有前途的杜氏肌营养不良症治疗方法，目前正在临床试验中进行测试。许多 AON 已在（患者来源的）培养的肌肉细胞和 mdx 小鼠模型中进行了测试。衡量 AON 效率的主要结果通常是外显子跳跃百分比，尽管不同的小组使用不同的方法来评估这些百分比。在这里，我们比较了一系列技术来量化 AON 处理的 mdx 小鼠肌肉中的外显子跳跃水平。我们比较了 RT-PCR 产物在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上的光密度测定、初级和巢式 RT-PCR，然后是生物分析仪分析和熔解曲线分析。数字阵列系统 (Fluidigm) 允许对跳过和未跳过的转录本进行绝对量化，并用作参考。数字阵列结果表明，1 ng 的 mdx 腓肠肌肌肉衍生 mRNA 包含大约 1100 个抗肌萎缩蛋白转录物，而 665 个转录物足以确定外显子跳跃水平。使用生物分析仪或初级 PCR 产物的光密度分析进行定量，得到的值接近于数字阵列获得的值。使用相同的技术可以比较在 mdx 小鼠模型中处理外显子跳跃的不同小组。使用生物分析仪或初级 PCR 产物的光密度分析进行定量，得到的值接近于数字阵列获得的值。使用相同的技术可以比较在 mdx 小鼠模型中处理外显子跳跃的不同小组。使用生物分析仪或初级 PCR 产物的光密度分析进行定量，得到的值接近于数字阵列获得的值。使用相同的技术可以比较在 mdx 小鼠模型中处理外显子跳跃的不同小组。