BACKGROUND We evaluated a clinical-grade protocol for the manufacture of mature DC from CD14 + precursors derived from normal donors and patients suffering from CML and stage IV malignant melanoma. We manufactured six products for CML patients and five for melanoma patients and administered them as vaccines in phase I clinical trials. METHODS We isolated CD 14+ cells from apheresis products by immunomagnetic separation and incubated them in X-VIVO 15' medium supplemented with human AB serum, GM-CSF and IL-4 for 7 days, and with additional tumor necrosis factor (TNF)-a, IL-lIf, IL-6 and prostaglandin E2 for 3 days. Some cells were electroporated and transfected with mRNA isolated from melanoma tissue. DC were characterized by flow cytometry for the expression of CD83, CD86 andCD14. RESULTS CD14+ cells constituted 14.4+/-6.2% (mean + SD) of nucleated cells in apheresis products and 98.3+/- 3.6% of isolated cells. Normal DC and CML DC were 77.4+/-7.3% CD83+ and 93.5+/- 7.0% CD86+. Corresponding values for electroporated DC from melanoma patients were 66.1 + 7.2% and 94.1 + 7.8%. The yield of CD83+ DC from isolated CD14+ cells was 18.1 + 7.2% for normal and CML patients and 9.8 + 3.7% for melanoma patients. DC viability was 92.7 + 5.8%; after cryopreservation and thawing it was 77+/-13.5%. DISCUSSION Our method yielded viable and mature DC free of bacteria and mycoplasma. This robust and reproducible method provides cells of consistent phenotype and viability. Cryopreservation in single-dose aliquots allows multiple DC vaccine doses to be manufactured from a single apheresis product.

中文翻译：

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CD14+ 前体 DC 的临床级制造：CML 和恶性黑色素瘤 I 期临床试验的经验

背景我们评估了用于从来自正常供体和患有 CML 和 IV 期恶性黑色素瘤的患者的 CD14 + 前体制造成熟 DC 的临床级方案。我们为 CML 患者生产了 6 种产品，为黑色素瘤患者生产了 5 种产品，并在 I 期临床试验中将它们作为疫苗给药。方法我们通过免疫磁性分离从单采产品中分离出 CD 14+ 细胞，并将它们在添加了人 AB 血清、GM-CSF 和 IL-4 以及额外的肿瘤坏死因子 (TNF)-的 X-VIVO 15' 培养基中培养 7 天。 a，IL-1If、IL-6 和前列腺素 E2 3 天。一些细胞被电穿孔并用从黑素瘤组织中分离的mRNA转染。DC通过流式细胞术表征CD83、CD86和CD14的表达。结果 CD14+细胞构成14.4+/-6。单采产品中有 2%（平均值 + SD）的有核细胞和 98.3+/- 3.6% 的分离细胞。正常 DC 和 CML DC 为 77.4+/-7.3% CD83+ 和 93.5+/-7.0% CD86+。来自黑色素瘤患者的电穿孔 DC 的相应值为 66.1 + 7.2% 和 94.1 + 7.8%。来自分离的 CD14+ 细胞的 CD83+ DC 的产量对于正常和 CML 患者为 18.1 + 7.2%，对于黑色素瘤患者为 9.8 + 3.7%。DC 存活率为 92.7 + 5.8%；冷冻保存和解冻后为 77+/-13.5%。讨论 我们的方法产生了无细菌和支原体的可行且成熟的 DC。这种稳健且可重复的方法提供了具有一致表型和活力的细胞。单剂量等份冷冻保存允许从单个单采产品生产多个 DC 疫苗剂量。正常 DC 和 CML DC 为 77.4+/-7.3% CD83+ 和 93.5+/-7.0% CD86+。来自黑色素瘤患者的电穿孔 DC 的相应值为 66.1 + 7.2% 和 94.1 + 7.8%。来自分离的 CD14+ 细胞的 CD83+ DC 的产量对于正常和 CML 患者为 18.1 + 7.2%，对于黑色素瘤患者为 9.8 + 3.7%。DC 存活率为 92.7 + 5.8%；冷冻保存和解冻后为 77+/-13.5%。讨论 我们的方法产生了无细菌和支原体的可行且成熟的 DC。这种稳健且可重复的方法提供了具有一致表型和活力的细胞。单剂量等份冷冻保存允许从单个单采产品生产多个 DC 疫苗剂量。正常 DC 和 CML DC 为 77.4+/-7.3% CD83+ 和 93.5+/-7.0% CD86+。来自黑色素瘤患者的电穿孔 DC 的相应值为 66.1 + 7.2% 和 94.1 + 7.8%。来自分离的 CD14+ 细胞的 CD83+ DC 的产量对于正常和 CML 患者为 18.1 + 7.2%，对于黑色素瘤患者为 9.8 + 3.7%。DC 存活率为 92.7 + 5.8%；冷冻保存和解冻后为 77+/-13.5%。讨论 我们的方法产生了无细菌和支原体的可行且成熟的 DC。这种稳健且可重复的方法提供了具有一致表型和活力的细胞。单剂量等份冷冻保存允许从单个单采产品生产多个 DC 疫苗剂量。来自分离的 CD14+ 细胞的 CD83+ DC 的产量对于正常和 CML 患者为 18.1 + 7.2%，对于黑色素瘤患者为 9.8 + 3.7%。DC 存活率为 92.7 + 5.8%；冷冻保存和解冻后为 77+/-13.5%。讨论 我们的方法产生了无细菌和支原体的可行且成熟的 DC。这种稳健且可重复的方法提供了具有一致表型和活力的细胞。单剂量等份冷冻保存允许从单个单采产品生产多个 DC 疫苗剂量。来自分离的 CD14+ 细胞的 CD83+ DC 的产量对于正常和 CML 患者为 18.1 + 7.2%，对于黑色素瘤患者为 9.8 + 3.7%。DC 存活率为 92.7 + 5.8%；冷冻保存和解冻后为 77+/-13.5%。讨论 我们的方法产生了无细菌和支原体的可行且成熟的 DC。这种稳健且可重复的方法提供了具有一致表型和活力的细胞。单剂量等份冷冻保存允许从单个单采产品生产多个 DC 疫苗剂量。这种稳健且可重复的方法提供了具有一致表型和活力的细胞。单剂量等份冷冻保存允许从单个单采产品生产多个 DC 疫苗剂量。这种稳健且可重复的方法提供了具有一致表型和活力的细胞。单剂量等份冷冻保存允许从单个单采产品生产多个 DC 疫苗剂量。