Single-domain antibodies (sdAbs), the variable domains of camelid heavy chain-only antibodies, are generally thought to poorly recognize nonproteinaceous small molecules and carbohydrates in comparison with conventional antibodies. However, the structures of anti-methotrexate, anti-triclocarban and anti-cortisol sdAbs revealed unexpected contributions of the non-hypervariable "CDR4" loop, formed between β-strands D and E of framework region 3, in binding. Here, we investigated the potential role of CDR4 in sdAb binding to a hapten, 15-acetyl-deoxynivalenol (15-AcDON), and to carbohydrates. We constructed and panned a phage-displayed library in which CDR4 of the 15-AcDON-specific sdAb, NAT-267, was extended and randomized. From this library, we identified one sdAb, MA-232, bearing a 14-residue insertion in CDR4 and showing improved binding to 15-AcDON by ELISA and surface plasmon resonance. On the basis of these results, we constructed a second set of phage-displayed libraries in which the CDR4 and other regions of three hapten- or carbohydrate-binding sdAbs were diversified. With the goal of identifying sdAbs with novel glycan-binding specificities, we panned the library against four tumor-associated carbohydrate antigens but were unable to enrich binding phages. Thus, we conclude that while CDR4 may play a role in binding of some rare hapten-specific sdAbs, diversifying this region through molecular engineering is probably not a general solution to sdAb carbohydrate recognition in the absence of a paired VL domain.

中文翻译：

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不可改变的FR3 DE环在半抗原和碳水化合物的单域抗体识别中的作用。

与传统抗体相比，单域抗体（sdAb）是仅骆驼科重链抗体的可变域，通常被认为无法识别非蛋白质的小分子和碳水化合物。但是，抗甲氨蝶呤，抗三氯卡班和抗皮质醇sdAbs的结构揭示了在框架区3的β链D和E之间形成的非高变“ CDR4”环的意外贡献。在这里，我们调查了CDR4在sdAb与半抗原，15-乙酰基-脱氧雪腐烯醇（15-AcDON）和碳水化合物结合中的潜在作用。我们构建并淘选了噬菌体展示的文库，其中扩展了15-AcDON特异性sdAb的CDR4 NAT-267，并对其进行了随机分配。我们从这个资料库中识别出一个sdAb MA-232，在CDR4中具有14个残基的插入，并通过ELISA和表面等离振子共振显示出对15-AcDON的改善的结合。基于这些结果，我们构建了第二组噬菌体展示文库，其中三个半抗原或碳水化合物结合的sdAb的CDR4和其他区域多样化。为了鉴定具有新型聚糖结合特异性的sdAb，我们针对四种与肿瘤相关的碳水化合物抗原进行了淘选，但无法富集结合噬菌体。因此，我们得出的结论是，尽管CDR4可能在某些罕见的半抗原特异性sdAb的结合中发挥作用，但在没有配对VL结构域的情况下，通过分子工程使该区域多样化可能不是sdAb碳水化合物识别的一般解决方案。我们构建了第二组噬菌体展示文库，其中CDR4和三个结合半抗原或碳水化合物的sdAb的其他区域是多样化的。为了鉴定具有新型聚糖结合特异性的sdAb，我们针对四种与肿瘤相关的碳水化合物抗原进行了淘选，但无法富集结合噬菌体。因此，我们得出的结论是，尽管CDR4可能在某些罕见的半抗原特异性sdAb的结合中发挥作用，但在没有配对VL结构域的情况下，通过分子工程使该区域多样化可能不是sdAb碳水化合物识别的一般解决方案。我们构建了第二组噬菌体展示文库，其中CDR4和三个结合半抗原或碳水化合物的sdAb的其他区域是多样化的。为了鉴定具有新型聚糖结合特异性的sdAb，我们针对四种与肿瘤相关的碳水化合物抗原进行了淘选，但无法富集结合噬菌体。因此，我们得出的结论是，尽管CDR4可能在某些罕见的半抗原特异性sdAb的结合中发挥作用，但在没有配对VL结构域的情况下，通过分子工程使该区域多样化可能不是sdAb碳水化合物识别的一般解决方案。我们针对四种与肿瘤相关的碳水化合物抗原淘选了该文库，但无法富集结合噬菌体。因此，我们得出的结论是，尽管CDR4可能在某些罕见的半抗原特异性sdAb的结合中发挥作用，但在没有配对VL结构域的情况下，通过分子工程使该区域多样化可能不是sdAb碳水化合物识别的一般解决方案。我们针对四种与肿瘤相关的碳水化合物抗原淘选了该文库，但无法富集结合噬菌体。因此，我们得出的结论是，尽管CDR4可能在某些罕见的半抗原特异性sdAb的结合中发挥作用，但在没有配对VL结构域的情况下，通过分子工程使该区域多样化可能不是sdAb碳水化合物识别的一般解决方案。