Abstract Topoisomerase II (TOP2) resolves topologically entwined duplex DNA. It generates a transient DNA double-strand break intermediate, known as TOP2 cleavage complex (TOP2cc) that contains a covalent link between TOP2 and the 5′-terminus of the incised DNA duplex. Etoposide, a frontline anticancer drug, freezes the intermediate and forms irreversible TOP2ccs. Tyrosyl-DNA phosphodiesterase 2 (TDP2) is thought to repair irreversible TOP2ccs by hydrolyzing the phosphodiester bond between TOP2 and DNA after the proteasomal degradation of trapped TOP2ccs. However, the functional cooperation between TOP2 and proteasome in the repair of trapped TOP2ccs in vivo remains unknown. In this study, we analyze the repair of etoposide-induced TOP2ccs in wild-type and TDP2-deficient (TDP2–/–) TK6 cells in the absence and presence of MG132, a potent proteasome inhibitor. The results suggested that TOP2ccs were repaired by proteasome-dependent and proteasome-independent pathways. Both proteasome-dependent and proteasome-independent pathways were further subdivided into TDP2-dependent and TDP2-independent pathways, indicating that four pathways operate in the repair of TOP2ccs. In cell survival assays, MG132 increased the etoposide sensitivity of TDP2–/– cells, supporting the TDP2-independent and proteasome-dependent pathway among these multiple repair pathways. We also demonstrated that TDP2 released TOP2 from DNA that contained etoposide-induced TOP2cc without proteolytic degradation in vitro. Taken together, the present findings uncover novel proteasome-independent mechanisms for the repair of TOP2ccs.

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被困拓扑异构酶 II 共价切割复合物的修复：新的蛋白酶体独立机制

摘要拓扑异构酶 II (TOP2) 可解析拓扑缠绕的双链 DNA。它产生一个瞬时 DNA 双链断裂中间体，称为 TOP2 切割复合体 (TOP2cc)，它包含 TOP2 和切割的 DNA 双链体的 5'-末端之间的共价连接。依托泊苷是一种一线抗癌药物，可将中间体冻结并形成不可逆的 TOP2ccs。酪氨酰-DNA 磷酸二酯酶 2 (TDP2) 被认为通过在被捕获的 TOP2ccs 的蛋白酶体降解后水解 TOP2 和 DNA 之间的磷酸二酯键来修复不可逆的 TOP2ccs。然而，TOP2和蛋白酶体在体内修复被困TOP2ccs中的功能合作仍然未知。在这项研究中，我们分析了在不存在和存在 MG132 的情况下，依托泊苷诱导的 TOP2ccs 在野生型和 TDP2 缺陷 (TDP2–/–) TK6 细胞中的修复，一种有效的蛋白酶体抑制剂。结果表明TOP2ccs通过蛋白酶体依赖性和蛋白酶体非依赖性途径修复。蛋白酶体依赖性和蛋白酶体非依赖性途径进一步细分为 TDP2 依赖性和 TDP2 非依赖性途径，表明四种途径在 TOP2ccs 的修复中起作用。在细胞存活分析中，MG132 增加了 TDP2–/– 细胞对依托泊苷的敏感性，支持这些多种修复途径中的 TDP2 非依赖性和蛋白酶体依赖性途径。我们还证明 TDP2 从含有依托泊苷诱导的 TOP2cc 的 DNA 中释放 TOP2，而没有体外蛋白水解降解。总之，目前的研究结果揭示了 TOP2ccs 修复的新的蛋白酶体独立机制。结果表明TOP2ccs通过蛋白酶体依赖性和蛋白酶体非依赖性途径修复。蛋白酶体依赖性和蛋白酶体非依赖性途径进一步细分为 TDP2 依赖性和 TDP2 非依赖性途径，表明四种途径在 TOP2ccs 的修复中起作用。在细胞存活分析中，MG132 增加了 TDP2–/– 细胞对依托泊苷的敏感性，支持这些多种修复途径中的 TDP2 非依赖性和蛋白酶体依赖性途径。我们还证明 TDP2 从含有依托泊苷诱导的 TOP2cc 的 DNA 中释放 TOP2，而没有体外蛋白水解降解。总之，目前的研究结果揭示了 TOP2ccs 修复的新的蛋白酶体独立机制。结果表明TOP2ccs通过蛋白酶体依赖性和蛋白酶体非依赖性途径修复。蛋白酶体依赖性和蛋白酶体非依赖性途径进一步细分为 TDP2 依赖性和 TDP2 非依赖性途径，表明四种途径在 TOP2ccs 的修复中起作用。在细胞存活分析中，MG132 增加了 TDP2–/– 细胞对依托泊苷的敏感性，支持这些多种修复途径中的 TDP2 非依赖性和蛋白酶体依赖性途径。我们还证明 TDP2 从含有依托泊苷诱导的 TOP2cc 的 DNA 中释放 TOP2，而没有体外蛋白水解降解。综上所述，目前的研究结果揭示了 TOP2ccs 修复的新的蛋白酶体独立机制。蛋白酶体依赖性和蛋白酶体非依赖性途径进一步细分为 TDP2 依赖性和 TDP2 非依赖性途径，表明四种途径在 TOP2ccs 的修复中起作用。在细胞存活分析中，MG132 增加了 TDP2–/– 细胞对依托泊苷的敏感性，支持这些多种修复途径中的 TDP2 非依赖性和蛋白酶体依赖性途径。我们还证明 TDP2 从含有依托泊苷诱导的 TOP2cc 的 DNA 中释放 TOP2，而没有体外蛋白水解降解。总之，目前的研究结果揭示了 TOP2ccs 修复的新的蛋白酶体独立机制。蛋白酶体依赖性和蛋白酶体非依赖性途径进一步细分为 TDP2 依赖性和 TDP2 非依赖性途径，表明四种途径在 TOP2ccs 的修复中起作用。在细胞存活分析中，MG132 增加了 TDP2–/– 细胞对依托泊苷的敏感性，支持这些多种修复途径中的 TDP2 非依赖性和蛋白酶体依赖性途径。我们还证明 TDP2 从含有依托泊苷诱导的 TOP2cc 的 DNA 中释放 TOP2，而没有体外蛋白水解降解。总之，目前的研究结果揭示了 TOP2ccs 修复的新的蛋白酶体独立机制。在这些多种修复途径中支持 TDP2 独立和蛋白酶体依赖性途径。我们还证明 TDP2 从含有依托泊苷诱导的 TOP2cc 的 DNA 中释放 TOP2，而没有体外蛋白水解降解。总之，目前的研究结果揭示了 TOP2ccs 修复的新的蛋白酶体独立机制。在这些多种修复途径中支持 TDP2 独立和蛋白酶体依赖性途径。我们还证明 TDP2 从含有依托泊苷诱导的 TOP2cc 的 DNA 中释放 TOP2，而没有体外蛋白水解降解。总之，目前的研究结果揭示了 TOP2ccs 修复的新的蛋白酶体独立机制。