ABSTRACT Interphase phosphorylation of lamin-A,C depends dynamically on a cell's microenvironment, including the stiffness of extracellular matrix. However, phosphorylation dynamics is poorly understood for diseased forms such as progerin, a permanently farnesylated mutant of LMNA that accelerates aging of stiff and mechanically stressed tissues. Here, fine-excision alignment mass spectrometry (FEA-MS) is developed to quantify progerin and its phosphorylation levels in patient iPS cells differentiated to mesenchymal stem cells (MSCs). The stoichiometry of total A-type lamins (including progerin) versus B-type lamins measured for Progeria iPS-MSCs prove similar to that of normal MSCs, with total A-type lamins more abundant than B-type lamins. However, progerin behaves more like farnesylated B-type lamins in mechanically-induced segregation from nuclear blebs. Phosphorylation of progerin at multiple sites in iPS-MSCs cultured on rigid plastic is also lower than that of normal lamin-A and C. Reduction of nuclear tension upon i) cell rounding/detachment from plastic, ii) culture on soft gels, and iii) inhibition of actomyosin stress increases phosphorylation and degradation of lamin-C > lamin-A > progerin. Such mechano-sensitivity diminishes, however, with passage as progerin and DNA damage accumulate. Lastly, transcription-regulating retinoids exert equal effects on both diseased and normal A-type lamins, suggesting a differential mechano-responsiveness might best explain the stiff tissue defects in Progeria.

中文翻译：

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在 iPS 衍生的间充质干细胞中，间期早老蛋白磷酸化比 lamin-A、C 更低且机械敏感性更低

摘要 lamin-A、C 的间期磷酸化动态取决于细胞的微环境，包括细胞外基质的硬度。然而，人们对诸如早老素等疾病形式的磷酸化动力学了解甚少，早老素是 LMNA 的一种永久性法尼基化突变体，可加速僵硬和机械应力组织的老化。在这里，开发了精细切除比对质谱法 (FEA-MS) 来量化早老素及其在分化为间充质干细胞 (MSC) 的患者 iPS 细胞中的磷酸化水平。针对早衰 iPS-MSC 测量的总 A 型核纤层蛋白（包括早衰蛋白）与 B 型核纤层蛋白的化学计量证明与正常 MSC 相似，总 A 型核纤层蛋白比 B 型核纤层蛋白更丰富。然而，progerin 在机械诱导的核泡分离中表现得更像法尼基化 B 型核纤层蛋白。在硬质塑料上培养的 iPS-MSCs 中早老蛋白在多个位点的磷酸化也低于正常的 lamin-A 和 C。在 i) 细胞变圆/从塑料上脱离，ii) 在软凝胶上培养，和 iii 时核张力降低) 抑制肌动球蛋白应激会增加 lamin-C > lamin-A > progerin 的磷酸化和降解。然而，随着早老蛋白和 DNA 损伤的积累，这种机械敏感性会随着通道的通过而减弱。最后，转录调节类视黄醇对患病和正常的 A 型核纤层蛋白发挥相同的作用，这表明不同的机械反应性可能最好地解释早衰症中的僵硬组织缺陷。在硬质塑料上培养的 iPS-MSCs 中早老蛋白在多个位点的磷酸化也低于正常的 lamin-A 和 C。在 i) 细胞变圆/从塑料上脱离，ii) 在软凝胶上培养，和 iii 时核张力降低) 抑制肌动球蛋白应激会增加 lamin-C > lamin-A > progerin 的磷酸化和降解。然而，随着早老蛋白和 DNA 损伤的积累，这种机械敏感性会随着通道的通过而减弱。最后，转录调节类视黄醇对患病和正常的 A 型核纤层蛋白发挥相同的作用，这表明不同的机械反应性可能最好地解释早衰症中的僵硬组织缺陷。在硬质塑料上培养的 iPS-MSCs 中早老蛋白在多个位点的磷酸化也低于正常的 lamin-A 和 C。在 i) 细胞变圆/从塑料上脱离，ii) 在软凝胶上培养，和 iii 时核张力降低) 抑制肌动球蛋白应激会增加 lamin-C > lamin-A > progerin 的磷酸化和降解。然而，随着早老蛋白和 DNA 损伤的积累，这种机械敏感性会随着通道的通过而减弱。最后，转录调节类视黄醇对患病和正常的 A 型核纤层蛋白发挥相同的作用，这表明不同的机械反应性可能最好地解释早衰症中的僵硬组织缺陷。iii) 抑制肌动球蛋白应激会增加 lamin-C > lamin-A > progerin 的磷酸化和降解。然而，随着早老蛋白和 DNA 损伤的积累，这种机械敏感性会随着通道的通过而减弱。最后，转录调节类视黄醇对患病和正常的 A 型核纤层蛋白发挥相同的作用，这表明不同的机械反应性可能最好地解释早衰症中的僵硬组织缺陷。iii) 抑制肌动球蛋白应激会增加 lamin-C > lamin-A > progerin 的磷酸化和降解。然而，随着早老蛋白和 DNA 损伤的积累，这种机械敏感性会随着通道的通过而减弱。最后，转录调节类视黄醇对患病和正常的 A 型核纤层蛋白发挥相同的作用，这表明不同的机械反应性可能最好地解释早衰症中的僵硬组织缺陷。