Due to limitations in commercial diagnostic methods, this study aimed to develop a reliable real-time polymerase chain reaction (Rt-PCR) assay for early diagnosis of brucellosis. Optimization of the Rt-PCR method was performed on serum samples spiked by Brucella melitensis with different densities ranging from 101 to 108 colony-forming units (cfu)/mL; each density was prepared in ten samples. The limit of detection was investigated by using Thermo DNA extraction kit with Maxima SYBR Green Rt-PCR and two TaqMan probe-based Rt-PCR protocols performed by QuantiTect and TEMPase multiplex PCR master mixes in two thermal cyclers, which were Rotor-Gene and Bio-Rad. The validation of the optimized protocol was carried on 20 brucellosis-negative samples and 20 samples spiked with B. melitensis by using a combination of Thermo DNA extraction kit with TEMPase PCR master mix. SYBR Green Rt-PCR yielded positive results on all samples having ≥ 104 cfu/mL of B. melitensis in both thermal cyclers. Its limit of detection was 112 DNA copies per reaction. The positivity of both probe-based Rt-PCR protocols was 100% and 80% on the samples having 103 cfu/mL and 102 cfu/mL of B. melitensis, respectively. The limit of detection of probe-based protocols was defined as 4 DNA copies per reaction. The optimized Rt-PCR protocol showed high-level accuracy, precision, specificity, and sensitivity, each having a rate of 100%. The current study indicated that the TaqMan probe-based Rt-PCR protocol optimized and validated with serum samples can be reliably used for early diagnosis of brucellosis.

中文翻译：

---

实时聚合酶链反应规程的优化和验证，用于诊断人类布鲁氏菌病。

由于商业诊断方法的局限性，本研究旨在开发一种可靠的实时聚合酶链反应（Rt-PCR）分析法，用于布鲁氏菌病的早期诊断。Rt-PCR方法的优化是在浓度为101至108个菌落形成单位（cfu）/ mL的不同浓度布鲁氏菌加标的血清样品上进行的。每个密度准备十个样品。通过使用具有Maxima SYBR Green Rt-PCR的Thermo DNA提取试剂盒和QuantiTect和TEMPase多重PCR预混液在两个热循环仪（Rotor-Gene和Bio）中进行的两个基于TaqMan探针的Rt-PCR方案来研究检测限-拉德 对20个布鲁氏菌病阴性样本和20个掺有B的样本进行了优化方案的验证。结合使用Thermo DNA提取试剂盒和TEMPase PCR预混液。SYBR Green Rt-PCR在两个热循环仪中对所有≥104 cfu / mL的B. melitensis样品均产生阳性结果。其检测极限是每个反应112个DNA拷贝。两种基于探针的Rt-PCR方案的阳性率分别为103. cfu / mL和102 cfu / mL的B. melitensis。基于探针的方案的检测极限被定义为每个反应4个DNA拷贝。优化的Rt-PCR方案显示出高水平的准确性，精密度，特异性和灵敏性，每个比率均为100％。当前的研究表明，用血清样品进行优化和验证的基于TaqMan探针的Rt-PCR方案可以可靠地用于布鲁氏菌病的早期诊断。SYBR Green Rt-PCR在两个热循环仪中对所有≥104 cfu / mL的B. melitensis样品均产生阳性结果。其检测极限是每个反应112个DNA拷贝。两种基于探针的Rt-PCR方案的阳性率分别为103. cfu / mL和102 cfu / mL的B. melitensis。基于探针的方案的检测极限被定义为每个反应4个DNA拷贝。优化的Rt-PCR方案显示出高水平的准确性，精密度，特异性和灵敏性，每个比率均为100％。当前的研究表明，以血清样品进行优化和验证的基于TaqMan探针的Rt-PCR方案可以可靠地用于布鲁氏菌病的早期诊断。SYBR Green Rt-PCR在两个热循环仪中对所有≥104 cfu / mL的B. melitensis样品均产生阳性结果。其检测极限是每个反应112个DNA拷贝。两种基于探针的Rt-PCR方案的阳性率分别为103. cfu / mL和102 cfu / mL的B. melitensis。基于探针的方案的检测极限被定义为每个反应4个DNA拷贝。优化的Rt-PCR方案显示出高水平的准确性，精密度，特异性和灵敏性，每个比率均为100％。当前的研究表明，用血清样品进行优化和验证的基于TaqMan探针的Rt-PCR方案可以可靠地用于布鲁氏菌病的早期诊断。两种基于探针的Rt-PCR方案的阳性率分别为103. cfu / mL和102 cfu / mL的B. melitensis。基于探针的方案的检测极限被定义为每个反应4个DNA拷贝。优化的Rt-PCR方案显示出高水平的准确性，精密度，特异性和灵敏性，每个比率均为100％。当前的研究表明，用血清样品进行优化和验证的基于TaqMan探针的Rt-PCR方案可以可靠地用于布鲁氏菌病的早期诊断。两种基于探针的Rt-PCR方案的阳性率分别为103. cfu / mL和102 cfu / mL的B. melitensis。基于探针的方案的检测极限被定义为每个反应4个DNA拷贝。优化的Rt-PCR方案显示出高水平的准确性，精密度，特异性和灵敏性，每个比率均为100％。当前的研究表明，用血清样品进行优化和验证的基于TaqMan探针的Rt-PCR方案可以可靠地用于布鲁氏菌病的早期诊断。和敏感度各占100％。当前的研究表明，用血清样品进行优化和验证的基于TaqMan探针的Rt-PCR方案可以可靠地用于布鲁氏菌病的早期诊断。和敏感度各占100％。当前的研究表明，用血清样品进行优化和验证的基于TaqMan探针的Rt-PCR方案可以可靠地用于布鲁氏菌病的早期诊断。