BACKGROUND The CRISPR/Cas system is a powerful genome editing tool that enables targeted genome modifications in various organisms. In medaka (Oryzias latipes), targeted mutagenesis with small insertions and deletions using this system have become a robust technique and are now widely used. However, to date there have been only a small number of reports on targeted gene integration using this system. We thus sought in the present study to identify factors that enhance the efficiency of targeted gene integration events in medaka. RESULTS We show that longer homology arms (ca. 500 bp) and linearization of circular donor plasmids by cleavage with bait sequences enhances the efficiency of targeted integration of plasmids in embryos. A new bait sequence, BaitD, which we designed and selected by in silico screening, achieved the highest efficiency of the targeted gene integration in vivo. Using this system, donor plasmids integrated precisely at target sites and were efficiently transmitted to progeny. We also report that the genotype of F2 siblings, obtained by mating of individuals harboring two different colors of fluorescent protein genes (e.g. GFP and RFP) in the same locus, can be easily and rapidly determined non-invasively by visual observations alone. CONCLUSION We report that the efficiency of targeted gene integration can be enhanced by using donor vectors with longer homologous arms and linearization using a highly active bait system in medaka. These findings may contribute to the establishment of more efficient systems for targeted gene integration in medaka and other fish species.

中文翻译：

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一个有效的系统，用于在高中（Oryzias latipes）中进行依赖于同源性的基因整合。

背景技术CRISPR / Cas系统是功能强大的基因组编辑工具，其使得能够在各种生物中进行靶向的基因组修饰。在medaka（Oryzias latipes）中，使用此系统的靶向插入，少量插入和缺失诱变已成为一项可靠的技术，现已广泛使用。但是，迄今为止，只有很少的关于使用该系统进行靶向基因整合的报道。因此，我们在本研究中寻找以鉴定可增强medaka中靶向基因整合事件效率的因素。结果我们显示更长的同源臂（约500 bp）和通过用诱饵序列切割使环状供体质粒线性化提高了质粒在胚胎中靶向整合的效率。我们通过计算机筛选设计并选择了一种新的诱饵序列BaitD，在体内实现了靶向基因整合的最高效率。使用该系统，供体质粒精确地整合在靶位点，并有效地传递给后代。我们还报告说，仅通过视觉观察就可以轻松，快速地通过非侵入性方式确定通过在同一基因座中携带两种不同颜色的荧光蛋白基因（例如GFP和RFP）的个体交配而获得的F2兄弟姐妹的基因型。结论我们报告说，通过使用具有更长同源臂的供体载体和在高中的高活性诱饵系统进行线性化可以提高靶向基因整合的效率。这些发现可能有助于建立更有效的系统来在和其他鱼类中进行靶向基因整合。供体质粒精确整合在靶位点，并有效地传递给后代。我们还报告说，仅通过视觉观察就可以轻松，快速地通过非侵入性方式确定通过在同一基因座中携带两种不同颜色的荧光蛋白基因（例如GFP和RFP）的个体交配而获得的F2兄弟姐妹的基因型。结论我们报告说，通过使用具有更长同源臂的供体载体和在高中的高活性诱饵系统进行线性化可以提高靶向基因整合的效率。这些发现可能有助于建立更有效的系统来在和其他鱼类中进行靶向基因整合。供体质粒精确整合在靶位点，并有效地传递给后代。我们还报告说，仅通过视觉观察就可以轻松，快速地通过非侵入性方式确定通过在同一基因座中携带两种不同颜色的荧光蛋白基因（例如GFP和RFP）的个体交配而获得的F2兄弟姐妹的基因型。结论我们报告说，通过使用具有更长同源臂的供体载体和在高中的高活性诱饵系统进行线性化，可以提高靶向基因整合的效率。这些发现可能有助于建立更有效的系统来在和其他鱼类中进行靶向基因整合。通过将携带两种不同颜色的荧光蛋白基因（例如GFP和RFP）的个体在同一位点交配而获得的单抗，仅通过肉眼观察就可以轻松，快速地确定。结论我们报告说，通过使用具有更长同源臂的供体载体和在高中的高活性诱饵系统进行线性化，可以提高靶向基因整合的效率。这些发现可能有助于建立更有效的系统来在和其他鱼类中进行靶向基因整合。通过将携带两种不同颜色的荧光蛋白基因（例如GFP和RFP）的个体在同一位点交配而获得的单抗，仅通过肉眼观察就可以轻松，快速地确定。结论我们报告说，通过使用具有更长同源臂的供体载体和在高中的高活性诱饵系统进行线性化可以提高靶向基因整合的效率。这些发现可能有助于建立更有效的系统来在和其他鱼类中进行靶向基因整合。结论我们报告说，通过使用具有更长同源臂的供体载体和在高中的高活性诱饵系统进行线性化可以提高靶向基因整合的效率。这些发现可能有助于建立更有效的系统来在和其他鱼类中进行靶向基因整合。结论我们报告说，通过使用具有更长同源臂的供体载体和在高中的高活性诱饵系统进行线性化，可以提高靶向基因整合的效率。这些发现可能有助于建立更有效的系统来在和其他鱼类中进行靶向基因整合。