BACKGROUND Cardiac arrest, and the associated arrest of blood circulation, immediately leads to permanent brain damage because of the exhaustion of oxygen, glucose and energy resources in the brain. Most hippocampal CA1 neurons die during the first week post the insult. Molecular data concerning the recovery after resuscitation are sparse and limited to the early time period. Expression analysis of marker genes via quantitative real-time RT-PCR enables to follow up the remodeling process. However, proper validation of the applied normalization strategy is a crucial prerequisite for reliable conclusions.Therefore, the present study aimed to determine the expression stability of ten commonly used reference genes (Actb, actin, beta; B2m, beta-2 microglobulin;CypA, cyclophilin A; Gapdh, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; Hprt, hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase; Pgk1, phosphoglycerate kinase 1; Rpl13a, ribosomal protein L13A; Sdha, succinat dehydrogenase complex, subunit a, flavoprotein (Fp); Tbp, TATA box binding protein; Ywhaz, tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, zeta polypeptide) in the rat hippocampus four, seven and twenty-one days after cardiac arrest. Moreover, experimental groups treated with the anti-inflammatory and anti-apoptotic drug minocycline have been included in the study as well. RESULTS The microglial marker Mac-1, used as a target gene to validate the experimental model, was found to be upregulated about 10- to 20-fold after cardiac arrest. Expression stability of candidate reference genes was analyzed using geNorm and NormFinder software tools. Several of these genes behave rather stable. CypA and Pgk1 were identified by geNorm as the two most stable genes 4 and 21 days after asphyxial cardiac arrest, CypA and Gapdh at 7 days post treatment. B2m turned out to be the most variable candidate reference gene, being about 2-fold upregulated in the cardiac arrest treatment groups. CONCLUSION We have validated endogenous control genes for qRT-PCR analysis of gene expression in rat hippocampus after resuscitation from cardiac arrest. For normalization purposes in gene profiling studies a combination of CypA and Pgk1 should be considered 4 and 21 days post injury, whereas CypA and Gapdh is the best combination at 7 days. CypA is most favorable if restriction to a single reference gene for all time points is required.

中文翻译：

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在大鼠窒息性心脏骤停模型中选择用于定量实时 PCR 的参考基因。

背景技术心脏骤停以及相关的血液循环停止，由于脑中氧气、葡萄糖和能量资源的耗尽而立即导致永久性脑损伤。大多数海马 CA1 神经元在损伤后的第一周内死亡。有关复苏后恢复的分子数据很少且仅限于早期。通过定量实时 RT-PCR 对标记基因的表达分析能够跟踪重塑过程。然而，正确验证所应用的标准化策略是获得可靠结论的关键先决条件。 因此，本研究旨在确定十种常用参考基因​​（Actb、肌动蛋白、β；B2m、β-2 微球蛋白；CypA、亲环蛋白 A；Gapdh，3-磷酸甘油醛脱氢酶；Hprt，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶；Pgk1，磷酸甘油酸激酶 1；Rpl13a，核糖体蛋白L13A；Sdha，琥珀酸脱氢酶复合物，亚基 a，黄素蛋白 (Fp)；Tbp，TATA盒结合蛋白；Ywhaz、酪氨酸 3-单加氧酶/色氨酸 5-单加氧酶激活蛋白、zeta 多肽）在心脏骤停后 4、7 和 21 天的大鼠海马中。此外，研究中还包括用抗炎和抗凋亡药物米诺环素治疗的实验组。结果发现用作验证实验模型的靶基因的小胶质细胞标记物 Mac-1 在心脏骤停后上调了约 10 至 20 倍。使用 geNorm 和 NormFinder 软件工具分析候选参考基因的表达稳定性。这些基因中有几个表现得相当稳定。CypA 和 Pgk1 被 geNorm 鉴定为窒息性心脏骤停后 4 天和 21 天的两个最稳定的基因，即治疗后 7 天的 CypA 和 Gapdh。结果证明，B2m 是变化最大的候选参考基因，在心脏骤停治疗组中上调了约 2 倍。结论 我们已经验证了用于从心脏骤停复苏后大鼠海马中基因表达的 qRT-PCR 分析的内源性对照基因。为了基因分析研究中的标准化目的，应在损伤后 4 天和 21 天考虑 CypA 和 Pgk1 的组合，而 CypA 和 Gapdh 是第 7 天的最佳组合。如果需要限制所有时间点的单个参考基因，CypA 是最有利的。处理后 7 天的 CypA 和 Gapdh。结果证明，B2m 是变化最大的候选参考基因，在心脏骤停治疗组中上调了约 2 倍。结论我们已经验证了用于从心脏骤停复苏后大鼠海马中基因表达的 qRT-PCR 分析的内源性对照基因。为了基因分析研究中的标准化目的，应在损伤后 4 天和 21 天考虑 CypA 和 Pgk1 的组合，而 CypA 和 Gapdh 是第 7 天的最佳组合。如果需要限制所有时间点的单个参考基因，CypA 是最有利的。处理后 7 天的 CypA 和 Gapdh。结果证明，B2m 是变化最大的候选参考基因，在心脏骤停治疗组中上调了约 2 倍。结论 我们已经验证了用于从心脏骤停复苏后大鼠海马中基因表达的 qRT-PCR 分析的内源性对照基因。为了基因分析研究中的标准化目的，应在损伤后 4 天和 21 天考虑 CypA 和 Pgk1 的组合，而 CypA 和 Gapdh 是第 7 天的最佳组合。如果需要限制所有时间点的单个参考基因，CypA 是最有利的。结论我们已经验证了用于从心脏骤停复苏后大鼠海马中基因表达的 qRT-PCR 分析的内源性对照基因。为了基因分析研究中的标准化目的，应在损伤后 4 天和 21 天考虑 CypA 和 Pgk1 的组合，而 CypA 和 Gapdh 是第 7 天的最佳组合。如果需要限制所有时间点的单个参考基因，CypA 是最有利的。结论我们已经验证了用于从心脏骤停复苏后大鼠海马中基因表达的 qRT-PCR 分析的内源性对照基因。为了基因分析研究中的标准化目的，应在损伤后 4 天和 21 天考虑 CypA 和 Pgk1 的组合，而 CypA 和 Gapdh 是第 7 天的最佳组合。如果需要限制所有时间点的单个参考基因，CypA 是最有利的。