BACKGROUND Phi29 polymerase based amplification methods provides amplified DNA with minimal changes in sequence and relative abundance for many biomedical applications. RNA virus detection using microarrays, however, can present a challenge because phi29 DNA polymerase cannot amplify RNA nor small cDNA fragments (<2000 bases) obtained by reverse transcription of certain viral RNA genomes. Therefore, ligation of cDNA fragments is necessary prior phi29 polymerase based amplification. We adapted the QuantiTect Whole Transcriptome Kit (Qiagen) to our purposes and designated the method as Whole Transcriptome Amplification (WTA). RESULTS WTA successfully amplified cDNA from a panel of RNA viruses representing the diversity of ribovirus genome sizes. We amplified a range of genome copy numbers from 15 to 4 x 10(7) using WTA, which yielded quantities of amplified DNA as high as 1.2 microg/microl or 10(10) target copies. The amplification factor varied between 10(9) and 10(6). We also demonstrated that co-amplification occurred when viral RNA was mixed with bacterial DNA. CONCLUSION This is the first report in the scientific literature showing that a modified WGA (WTA) approach can be successfully applied to viral genomic RNA of all sizes. Amplifying viral RNA by WTA provides considerably better sensitivity and accuracy of detection compared to random RT-PCR.

中文翻译：

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基于 Phi29 聚合酶的病毒 RNA 随机扩增作为随机 RT-PCR 的替代方法。

背景基于Phi29聚合酶的扩增方法为许多生物医学应用提供序列和相对丰度变化最小的扩增DNA。然而，使用微阵列进行 RNA 病毒检测可能存在挑战，因为 phi29 DNA 聚合酶不能扩增 RNA，也不能扩增通过逆转录某些病毒 RNA 基因组获得的小 cDNA 片段（<2000 个碱基）。因此，在基于 phi29 聚合酶的扩增之前，必须连接 cDNA 片段。我们根据我们的目的调整了 QuantiTect Whole Transcriptome Kit (Qiagen)，并将该方法指定为 Whole Transcriptome Amplification (WTA)。结果 WTA 成功地从一组代表核糖病毒基因组大小多样性的 RNA 病毒中扩增了 cDNA。我们使用 WTA 扩增了从 15 到 4 x 10(7) 的一系列基因组拷贝数，这产生了高达 1.2 microg/microl 或 10(10) 个目标拷贝的扩增 DNA。放大系数在 10(9) 和 10(6) 之间变化。我们还证明了当病毒 RNA 与细菌 DNA 混合时会发生共扩增。结论 这是科学文献中的第一份报告，表明改进的 WGA (WTA) 方法可以成功应用于各种大小的病毒基因组 RNA。与随机 RT-PCR 相比，通过 WTA 扩增病毒 RNA 提供了更好的检测灵敏度和准确性。结论 这是科学文献中的第一份报告，表明改进的 WGA (WTA) 方法可以成功应用于各种大小的病毒基因组 RNA。与随机 RT-PCR 相比，通过 WTA 扩增病毒 RNA 提供了更好的检测灵敏度和准确性。结论 这是科学文献中的第一份报告，表明改进的 WGA (WTA) 方法可以成功应用于各种大小的病毒基因组 RNA。与随机 RT-PCR 相比，通过 WTA 扩增病毒 RNA 提供了更好的检测灵敏度和准确性。