Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate [PtdIns(3,4)P2] is a phosphoinositide that plays important roles in signal transduction, endocytosis, and cell migration among others. The intracellular distribution of PtdIns(3,4)P2 has mainly been studied by observing the distribution of GFP-tagged PtdIns(3,4)P2-binding protein domains in live cells and by labeling with anti-PtdIns(3,4)P2 antibody in fixed cell samples, but these methods only offer low spatial resolution results and may have pitfalls. In the present study, we developed an electron microscopic method to observe the PtdIns(3,4)P2 distribution using the SDS-treated freeze-fracture replica labeling method. The recombinant GST-tagged pleckstrin homology (PH) domain of TAPP1 was used as the binding probe, and its binding to PtdIns(3,4)P2 in the freeze-fracture replica was confirmed by using liposomes containing different phosphoinositides and by the lack of labeling by a mutant probe, in which one amino acid in the PH domain was substituted. The method was applied to NIH3T3 cell samples and showed that the increase of PtdIns(3,4)P2 in cells treated with hydrogen peroxide occurs in the cytoplasmic leaflet of the plasma membrane, except in the caveolar membrane. The present method can define the distribution of PtdIns(3,4)P2 at a high spatial resolution and will facilitate our understanding of the physiological function of this less studied phosphoinositide.

中文翻译：

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观察磷脂酰肌醇3,4-双磷酸酯分布的新电子显微镜方法。

磷脂酰肌醇3,4-二磷酸[PtdIns（3,4）P2]是一种磷酸肌醇，在信号转导，内吞和细胞迁移等过程中起着重要作用。PtdIns（3,4）P2的细胞内分布主要是通过观察GFP标记的PtdIns（3,4）P2结合蛋白结构域在活细胞中的分布以及通过用抗PtdIns（3,4）P2进行标记来研究的固定细胞样品中的抗体，但这些方法只能提供较低的空间分辨率结果，并且可能有陷阱。在本研究中，我们开发了一种电子显微镜方法，使用SDS处理的冷冻断裂复制标记方法观察PtdIns（3,4）P2的分布。TAPP1的重组GST标签的pleckstrin同源（PH）结构域用作结合探针，并与PtdIns结合（3，4）通过使用含有不同磷酸肌醇的脂质体和通过突变探针（其中PH结构域中的一个氨基酸被取代）的标记的缺乏，证实了冷冻断裂复制物中的P2。将该方法应用于NIH3T3细胞样品，结果表明，用过氧化氢处理的细胞中PtdIns（3,4）P2的增加发生在质膜的细胞质小叶中，除了小窝膜中。本方法可以在高空间分辨率下定义PtdIns（3,4）P2的分布，并且将有助于我们了解这一研究较少的磷酸肌醇的生理功能。将该方法应用于NIH3T3细胞样品，结果表明，用过氧化氢处理的细胞中PtdIns（3,4）P2的增加发生在质膜的细胞质小叶中，除了小窝膜中。本方法可以在高空间分辨率下定义PtdIns（3,4）P2的分布，并且将有助于我们了解这项研究较少的磷酸肌醇的生理功能。将该方法应用于NIH3T3细胞样品，结果表明，用过氧化氢处理的细胞中PtdIns（3,4）P2的增加发生在质膜的细胞质小叶中，除了小窝膜中。本方法可以在高空间分辨率下定义PtdIns（3,4）P2的分布，并且将有助于我们了解这一研究较少的磷酸肌醇的生理功能。