Actin, a major component of microfilaments, is involved in various eukaryotic cellular functions. Over the past two decades, actin fused with fluorescent protein has been used as a probe to detect the organization and dynamics of the actin cytoskeleton in living eukaryotic cells. It is generally assumed that the expression of fusion protein of fluorescent protein does not disturb the distribution of endogenous actin throughout the cell, and that the distribution of the fusion protein reflects that of endogenous actin. However, we noticed that EGFP-β-actin caused the excessive formation of microfilaments in several mammalian cell lines. To investigate whether the position of the EGFP tag on actin affected the formation of filaments, we constructed an expression vector harboring a β-actin-EGFP gene. In contrast to EGFP-β-actin, cells expressing β-actin-EGFP showed actin filaments in a high background from the monomer actin in cytosol. Additionally, the detergent insoluble assay revealed that the majority of the detergent-insoluble cytoskeleton from cells expressing EGFP-β-actin was recovered in the pellet. Furthermore, we found that the expression of EGFP-β-actin affects the migration of NBT-L2b cells and the mechanical stiffness of U2OS cells. These results indicate that EGFP fused to the N-terminus of actin tend to form excessive actin filaments. In addition, EGFP-actin affects both the cellular morphological and physiological phenotypes as compared to actin-EGFP.Key words: actin, GFP, cytoskeleton and probe.

中文翻译：

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GFP标签在肌动蛋白上的位置影响哺乳动物细胞中的细丝形成。

肌动蛋白是微丝的主要成分，参与各种真核细胞功能。在过去的二十年中，融合了荧光蛋白的肌动蛋白已被用作检测活真核细胞中肌动蛋白细胞骨架的组织和动力学的探针。通常认为荧光蛋白的融合蛋白的表达不会干扰内源性肌动蛋白在整个细胞中的分布，并且融合蛋白的分布反映了内源性肌动蛋白的分布。但是，我们注意到EGFP-β-肌动蛋白在几种哺乳动物细胞系中引起微丝的过度形成。为了研究肌动蛋白上EGFP标签的位置是否影响细丝的形成，我们构建了一个包含β-actin-EGFP基因的表达载体。与EGFP-β-肌动蛋白相反，表达β-肌动蛋白-EGFP的细胞比细胞质中的单体肌动蛋白在高背景中显示出肌动蛋白丝。另外，去污剂不溶性测定表明，从表达EGFP-β-肌动蛋白的细胞中大部分去污剂不溶性细胞骨架在沉淀物中回收。此外，我们发现EGFP-β-肌动蛋白的表达影响NBT-L2b细胞的迁移和U2OS细胞的机械刚度。这些结果表明，融合到肌动蛋白N末端的EGFP倾向于形成过量的肌动蛋白丝。此外，与肌动蛋白-EGFP相比，EGFP-肌动蛋白同时影响细胞的形态和生理表型。关键词：肌动蛋白，GFP，细胞骨架和探针 去污剂不溶性测定表明，从表达EGFP-β-肌动蛋白的细胞中大部分去污剂不溶性细胞骨架在沉淀物中回收。此外，我们发现EGFP-β-肌动蛋白的表达影响NBT-L2b细胞的迁移和U2OS细胞的机械刚度。这些结果表明，融合到肌动蛋白N末端的EGFP倾向于形成过量的肌动蛋白丝。此外，与肌动蛋白-EGFP相比，EGFP-肌动蛋白同时影响细胞的形态和生理表型。关键词：肌动蛋白，GFP，细胞骨架和探针 去污剂不溶性测定表明，从表达EGFP-β-肌动蛋白的细胞中大部分去污剂不溶性细胞骨架在沉淀物中回收。此外，我们发现EGFP-β-肌动蛋白的表达影响NBT-L2b细胞的迁移和U2OS细胞的机械刚度。这些结果表明，融合到肌动蛋白N末端的EGFP倾向于形成过量的肌动蛋白丝。此外，与肌动蛋白-EGFP相比，EGFP-肌动蛋白同时影响细胞的形态和生理表型。关键词：肌动蛋白，GFP，细胞骨架和探针 这些结果表明，融合到肌动蛋白N末端的EGFP倾向于形成过量的肌动蛋白丝。此外，与肌动蛋白-EGFP相比，EGFP-肌动蛋白同时影响细胞的形态和生理表型。关键词：肌动蛋白，GFP，细胞骨架和探针 这些结果表明，融合到肌动蛋白N末端的EGFP倾向于形成过量的肌动蛋白丝。此外，与肌动蛋白-EGFP相比，EGFP-肌动蛋白同时影响细胞的形态和生理表型。关键词：肌动蛋白，GFP，细胞骨架和探针