BACKGROUND Primordial germ cells (PGC) are the precursors of the gametes. During pre-natal development, PGC undergo an epigenetic reprogramming when bulk DNA demethylation occurs and is followed by sex-specific de novo methylation. The de novo methylation and the maintenance of the methylation patterns depend on DNA methyltransferases (DNMTs). PGC reprogramming has been widely studied in mice but not in rats. We have previously shown that the rat might be an interesting model to study germ cell development. In face of the difficulties of getting enough PGC for molecular studies, the aim of this study was to propose an alternative method to study rat PGC DNA methylation. Rat embryos were collected at 14, 15 and 19 days post-coitus (dpc) for the analysis of 5mC, 5hmC, DNMT1, DNMT3a and DNMT3b expression or at 16dpc for treatment 5-Aza-CdR, a DNMT inhibitor, in vitro. METHODS Once collected, the gonads were placed in 24-well plates previously containing 45μm pore membrane and medium with or without 5-Aza-CdR. The culture was kept for five days and medium was changed daily. The gonads were either fixed or submitted to RNA extraction. RESULTS 5mC and DNMTs labelling suggests that PGC are undergoing epigenetic reprogramming around 14/15dpc. The in vitro treatment of rat embryonic gonads with 1 μM of 5-Aza-CdR lead to a loss of 5mC labelling and to the activation of Pax6 expression in PGC, but not in somatic cells, suggesting that 5-Aza-CdR promoted a PGC-specific global DNA hypomethylation. CONCLUSIONS This study suggests that the protocol used here can be a potential method to study the wide DNA demethylation that takes place during PGC reprogramming.

中文翻译：

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研究大鼠原始生殖细胞表观遗传重编程的替代模型的初步研究。

背景技术原始生殖细胞（PGC）是配子的前体。在产前发育过程中，当大量DNA脱甲基发生时，PGC会进行表观遗传重编程，然后进行性别特异性从头甲基化。从头甲基化和甲基化模式的维持取决于DNA甲基转移酶（DNMT）。PGC重编程已在小鼠中进行了广泛研究，但在大鼠中尚未进行。先前我们已经表明，大鼠可能是研究生殖细胞发育的有趣模型。面对获得足够的PGC用于分子研究的困难，本研究的目的是提出一种研究大鼠PGC DNA甲基化的替代方法。在性交后第14、15和19天收集大鼠胚胎，以分析5mC，5hmC，DNMT1，DNMT3a和DNMT3b的表达，或在16dpc处处理5-Aza-CdR，体外DNMT抑制剂。方法一旦收集到性腺，就将其放置在24孔板中，该板先前包含45μm的孔膜和含有或不含5-Aza-CdR的培养基。将培养物保持五天，每天更换培养基。生殖腺被固定或接受RNA提取。结果5mC和DNMTs标记表明PGC正在14 / 15dpc附近进行表观遗传重编程。用1μM5-Aza-CdR体外处理大鼠胚胎性腺会导致5mC标记丢失，并导致PGC中Pax6表达的激活，但不能在体细胞中激活，表明5-Aza-CdR促进了PGC。特异的全局DNA低甲基化。结论这项研究表明，此处使用的方案可能是研究PGC重编程过程中发生的广泛DNA去甲基化的潜在方法。方法一旦收集到性腺，就将其放置在24孔板中，该板先前包含45μm的孔膜和含有或不含5-Aza-CdR的培养基。将培养物保持五天，每天更换培养基。生殖腺被固定或接受RNA提取。结果5mC和DNMTs标记表明PGC正在14 / 15dpc附近进行表观遗传重编程。用1μM5-Aza-CdR体外处理大鼠胚胎性腺会导致5mC标记丢失，并导致PGC中Pax6表达的激活，但不能在体细胞中激活，表明5-Aza-CdR促进了PGC。特异的全局DNA低甲基化。结论这项研究表明，此处使用的方案可能是研究PGC重编程过程中发生的广泛DNA去甲基化的潜在方法。方法一旦收集到性腺，就将其放置在24孔板中，该板先前含有45μm的孔膜和含有或不含5-Aza-CdR的培养基。将培养物保持五天，每天更换培养基。生殖腺被固定或接受RNA提取。结果5mC和DNMTs标记表明PGC正在14 / 15dpc附近进行表观遗传重编程。用1μM5-Aza-CdR体外处理大鼠胚胎性腺会导致5mC标记丢失，并导致PGC中Pax6表达的激活，但不能在体细胞中激活，表明5-Aza-CdR促进了PGC。特异的全局DNA低甲基化。结论这项研究表明，此处使用的方案可能是研究PGC重编程过程中发生的广泛DNA去甲基化的潜在方法。将性腺放置在24孔板中，该板先前包含45μm的孔膜和带有或不带有5-Aza-CdR的培养基。将培养物保持五天，每天更换培养基。生殖腺被固定或接受RNA提取。结果5mC和DNMTs标记表明PGC正在14 / 15dpc附近进行表观遗传重编程。用1μM5-Aza-CdR体外处理大鼠胚胎性腺会导致5mC标记丢失，并导致PGC中Pax6表达的激活，但不能在体细胞中激活，表明5-Aza-CdR促进了PGC。特异的全局DNA低甲基化。结论这项研究表明，此处使用的方案可能是研究PGC重编程过程中发生的广泛DNA去甲基化的潜在方法。将性腺放置在24孔板中，该板先前包含45μm的孔膜和带有或不带有5-Aza-CdR的培养基。将培养物保持五天，每天更换培养基。生殖腺被固定或接受RNA提取。结果5mC和DNMTs标记表明PGC正在14 / 15dpc附近进行表观遗传重编程。用1μM5-Aza-CdR体外处理大鼠胚胎性腺会导致5mC标记丢失，并导致PGC中Pax6表达的激活，但不能在体细胞中激活，表明5-Aza-CdR促进了PGC。特异的全局DNA低甲基化。结论这项研究表明，此处使用的方案可能是研究PGC重编程过程中发生的广泛DNA去甲基化的潜在方法。将培养物保持五天，每天更换培养基。生殖腺被固定或接受RNA提取。结果5mC和DNMTs标记表明PGC正在14 / 15dpc附近进行表观遗传重编程。用1μM5-Aza-CdR体外处理大鼠胚胎性腺会导致5mC标记丢失，并导致PGC中Pax6表达的激活，但不能在体细胞中激活，表明5-Aza-CdR促进了PGC。特异的全局DNA低甲基化。结论这项研究表明，此处使用的方案可能是研究PGC重编程过程中发生的广泛DNA去甲基化的潜在方法。将培养物保持五天，每天更换培养基。生殖腺被固定或接受RNA提取。结果5mC和DNMTs标记表明PGC正在14 / 15dpc附近进行表观遗传重编程。用1μM5-Aza-CdR体外处理大鼠胚胎性腺会导致5mC标记丢失，并导致PGC中Pax6表达的激活，但不能在体细胞中激活，表明5-Aza-CdR促进了PGC。特异的全局DNA低甲基化。结论这项研究表明，此处使用的方案可能是研究PGC重编程过程中发生的广泛DNA去甲基化的潜在方法。结果5mC和DNMTs标记表明PGC正在14 / 15dpc附近进行表观遗传重编程。用1μM5-Aza-CdR体外处理大鼠胚胎性腺会导致5mC标记丢失，并导致PGC中而不是体细胞中Pax6表达的激活，这表明5-Aza-CdR促进了PGC。特异的全局DNA低甲基化。结论这项研究表明，此处使用的方案可能是研究PGC重编程过程中发生的广泛DNA去甲基化的潜在方法。结果5mC和DNMTs标记表明PGC正在14 / 15dpc附近进行表观遗传重编程。用1μM5-Aza-CdR体外处理大鼠胚胎性腺会导致5mC标记丢失，并导致PGC中而不是体细胞中Pax6表达的激活，这表明5-Aza-CdR促进了PGC。特异的全局DNA低甲基化。结论这项研究表明，此处使用的方案可能是研究PGC重编程过程中发生的广泛DNA去甲基化的潜在方法。