BACKGROUND Satisfactory sample preparation for mass spectrometry-based analysis is a critical step in the proteomics workflow. The quality and reproducibility of sample preparation can determine the coverage and confidence of proteomics results. Up to date, several methodologies have been described to produce suitable peptides for mass spectrometry analysis, followed by strategies for enrichment of post-translational modified peptides, if desired. Among them, the filter-aided sample preparation (FASP) has been introduced as a method to allow for removal of denaturants, reductants, alkylators, lipids and nucleic acids prior to trypsin digestion. Despite the high proteolytic digestion and contaminant removal efficiency described for this method, filter failure and consequently complete sample loss can discourage the use of this approach by the proteomic community. RESULTS As judged by our quality controls, we were able to perform reliable and reproducible FASP for mass spectrometry analysis that allowed the quantification of 2141 proteins and 3694 phosphopeptides from as little as 20 and 320 μg of protein lysate from acute myeloid leukemia (AML) patients, respectively. Using the immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) method resulted in samples specifically enriched in phosphopeptides and allowed the quantification of a high number of both di- and multi-phosphopeptides in addition to the abundant mono-phosphopeptides. The workflows' high reproducibility from three biological replicates was demonstrated by the similar number of quantified proteins and localized phosphosites, and confirmed by the similar distributions of their molecular functions. We found that the combination of the FASP procedure with StageTip mixed-mode fractionation and IMAC are excellent workflows for the reproducible and deep study of AML proteomes and phosphoproteomes, respectively. CONCLUSIONS The FASP procedure can be carried out without the risk of filter failure by performing a simple test of the filter quality before adding the protein sample. Herein, we demonstrate an efficient and reproducible FASP-based pipeline for the proteomic and phosphoproteomic analysis of AML patient samples which also can be used for the analysis of any other protein samples.

中文翻译：

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基于FASP的可靠程序可对急性髓样白血病患者的样品进行最佳定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。

背景技术用于基于质谱的分析的令人满意的样品制备是蛋白质组学工作流程中的关键步骤。样品制备的质量和可重复性可以确定蛋白质组学结果的覆盖范围和置信度。迄今为止，已经描述了几种方法来产生用于质谱分析的合适的肽，如果需要的话，随后提出用于富集翻译后修饰的肽的策略。其中，已经引入了过滤辅助样品制备（FASP）作为一种方法，以允许在胰蛋白酶消化之前去除变性剂，还原剂，烷基化剂，脂质和核酸。尽管此方法具有很高的蛋白水解消化和污染物去除效率，过滤器故障并因此导致样品完全损失，可能会妨碍蛋白质组学人士使用这种方法。结果根据我们的质量控制判断，我们能够执行可靠且可重现的FASP进行质谱分析，从而可以定量分析急性髓样白血病（AML）患者中低至20和320μg的蛋白质裂解物中的2141个蛋白质和3694个磷酸肽， 分别。使用固定的金属离子亲和色谱法（IMAC），得到的样品中磷酸肽含量特别丰富，除了丰富的单磷酸肽外，还可以定量大量的二磷酸和多磷酸肽。工作流程的 定量的蛋白质和局部磷酸位点数量相近，证明了三种生物学复制品具有很高的重现性，分子功能的相似分布也证实了这一点。我们发现，FASP程序与StageTip混合模式分级分离和IMAC的组合分别是可重现和深入研究AML蛋白质组和磷酸化蛋白质组的出色工作流程。结论通过在添加蛋白质样品之前对过滤器质量进行简单测试，可以执行FASP程序而没有过滤器故障的风险。本文中，我们展示了一种有效且可重现的基于FASP的流水线，用于AML患者样品的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，也可用于分析任何其他蛋白质样品。并通过其分子功能的相似分布得到证实。我们发现，FASP程序与StageTip混合模式分级分离和IMAC的组合分别是可重现和深入研究AML蛋白质组和磷酸化蛋白质组的出色工作流程。结论通过在添加蛋白质样品之前对过滤器质量进行简单测试，可以执行FASP程序而没有过滤器故障的风险。本文中，我们展示了一种有效且可重现的基于FASP的流水线，用于AML患者样品的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，也可用于分析任何其他蛋白质样品。并通过其分子功能的相似分布得到证实。我们发现，FASP程序与StageTip混合模式分级分离和IMAC的组合分别是可重现和深入研究AML蛋白质组和磷酸化蛋白质组的出色工作流程。结论通过在添加蛋白质样品之前对过滤器质量进行简单测试，可以执行FASP程序而没有过滤器故障的风险。本文中，我们展示了一种有效且可重现的基于FASP的流水线，用于AML患者样品的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，也可用于分析任何其他蛋白质样品。我们发现，FASP程序与StageTip混合模式分级分离和IMAC的组合分别是可重现和深入研究AML蛋白质组和磷酸化蛋白质组的出色工作流程。结论通过在添加蛋白质样品之前对过滤器质量进行简单测试，可以执行FASP程序而没有过滤器故障的风险。本文中，我们展示了一种有效且可重现的基于FASP的流水线，用于AML患者样品的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，也可用于分析任何其他蛋白质样品。我们发现，FASP程序与StageTip混合模式分级分离和IMAC的组合分别是可重现和深入研究AML蛋白质组和磷酸化蛋白质组的出色工作流程。结论通过在添加蛋白质样品之前对过滤器质量进行简单测试，可以执行FASP程序而没有过滤器故障的风险。本文中，我们展示了一种有效且可重现的基于FASP的流水线，用于AML患者样品的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，也可用于分析任何其他蛋白质样品。