为了进一步证实Serpine2对HC再生的影响，作者繁育出纯合Serpine2-cOE小鼠。与两个对照组相比，可以观察到纯合Serpine2-cOE小鼠中的异位OHC明显更多，至少增加了3倍。此外，在Serpine2^loxp/+小鼠，Lgr5^EGFP-CreER/+Serpine2^loxp/+杂合cOE小鼠和Lgr5^EGFP-CreER/+Serpine2^loxp/loxp纯合cOE小鼠中，顶转、中转和底转处异位内毛细胞的数量呈增加趋势。在Lgr5^EGFP-CreER/+小鼠，Lgr5^EGFP-CreER/+Serpine2^loxp/+小鼠和Lgr5^EGFP-CreER/+Serpine2^loxp/loxp小鼠中，顶转异位外毛细胞的数量也有增加的趋势。这些结果表明，异位毛细胞和内毛细胞的数量随着Serpine2表达水平的增加而增加，表明Serpine2对异位毛细胞数量具有剂量依赖性。

利用EdU标记增殖细胞，结果显示Serpine2-cOE小鼠和对照小鼠的耳蜗中均不含有EdU+支持细胞，这表明异位毛细胞可能不是通过Lgr5+细胞进行有丝分裂后分化再生的。

接着作者通过将cOE小鼠与Rosa26-tdTomato小鼠杂交并进行谱系示踪实验发现，杂合和纯合的三阳性小鼠的耳蜗在其耳蜗顶转处含有显著更多的tdTomato+内毛细胞，结合上述EdU标记实验结果，表明体内耳蜗Lgr5+祖细胞中的Serpine2 条件过表达可能是通过促进Lgr5+祖细胞直接转分化为毛细胞而促进毛细胞再生的，而不是诱导有丝分裂促进再生。

为了进一步证明Serpine2对HC再生的影响，作者通过在Lgr5^EGFP-CreER/+Rosa26-tdTomato小鼠的耳蜗中分别使用siRNA和腺相关病毒（AAV）在体外和体内敲低Serpine2进行谱系追踪实验。在耳蜗外植体上利用针对Serpine2的siRNA（siRNA-Ser）处理发现，与对照组相比，Serpine2敲低可显着减少耳蜗外植体顶端和中转tdTomato+ HC的数量。利用siRNA Ser序列构建pAAV2 shRNA质粒，并将其包装到AAV ie中（AAV-Sh-Ser）中，与体外结果类似，新生小鼠耳蜗中AAV-Sh-Ser对Serpine2的体内敲低也显着减少了顶转tdTomato+ HC的数量。因此，体外和体内结果均表明，敲除Serpine2可以降低新生小鼠耳蜗中的毛细胞再生，这进一步支持了Serpine2 cOE小鼠的结果。

为了进一步探索Serpine2在HC再生中的机制，作者利用snRNA-seq来表征单细胞水平上的转录组差异。利用Monocl2轨迹分析来可视化两组中的分化轨迹和趋势，在Serpine2-cOE组的内外毛细胞的发展轨迹的中间有一部分未成熟内毛细胞（iIHC）和未成熟外毛细胞（iOHC），这与前述的表型结果一致，并进一步支持Serpine2-cOE能够诱导毛细胞再生。利用AUC评分和RT-qPCR验证，结果发现SHH信号通路活性在Serpine2 cOE组中显著下降，并且关键转录因子Atoh1和Pou4f3在Serpine2 cOE组中表现出显着更高的mRNA水平。这些结果表明，Serpine2-cOE主要通过抑制SHH途径和诱导Atoh1和Pou4f3转录因子来诱导毛细胞再生。

结论

作者利用Serpine2-cOE小鼠在新生小鼠耳蜗中的Lgr5+祖细胞中条件过表达Serpine2，与对照组小鼠相比，观察到显著更多的异位HC。相反，Serpine2敲低在体外和体内均能够抑制新生小鼠耳蜗中的HC再生。此外，EdU标记实验和谱系追踪实验结果表明，异位HC可能通过直接转分化再生，而不是通过有丝分裂再生。此外，snRNA-seq分析和RT-qPCR结果表明，Serpine2 cOE可能通过抑制SHH信号通路和诱导Atoh1和pouf4f3转录因子来促进HC再生。

期刊简介

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