UCSB杨扬团队Nat. Chem.：金属酶催化的不对称自由基去芳构化反应

催化不对称去芳构化反应可以将二维平面结构的芳香化合物立体选择性地转化为高附加值的三维立体分子骨架，从而极大拓展芳香化合物的化学转化以及产物的化学空间。然而，去芳构化反应需要破坏芳香化合物固有的芳香性，发展高效的不对称催化去芳构化反应并非易事。在过去的二十年里，已发展的过渡金属催化和有机小分子催化不对称去芳构化通常是双电子机制；由于调控自由基反应的立体选择性仍然具有很大的挑战，单电子机制的催化不对称去芳构化仍鲜有报道。近年来，一些具有催化芳香底物的去芳构化酶相继被发现报道，但是这些过程往往需要氧气参与，实用于不同类型的转化（图1a）。通过对酶的定向进化，若能在非氧化条件下，实现不同类型的芳香底物的催化不对称自由基去芳构化，那么将进一步扩大生物催化不对称去芳构化的应用范围。

近日，美国加州大学圣巴巴拉分校（UCSB）的杨扬教授（点击查看介绍）与匹兹堡大学的刘鹏教授（点击查看介绍）合作，利用非天然（new-to-nature）金属氧化还原生物催化策略，成功地实现了非天然自由基去芳构化酶P450_rad1–P450_rad5（通过定向进化得到）催化的吲哚、吡咯和酚的对映汇聚性和对映发散性自由基去芳构化（图1b–1d），以良好至优异的产率和对映选择性制备了一系列具有相邻季碳-季碳立体中心的螺环产物，该类骨架广泛存在于一些具有生物活性的天然产物和药物分子中（图1f）。可能的催化循环如下（图1e）：首先，亚铁血红素蛋白通过卤原子转移或单电子转移机制还原消旋α-溴羰基底物I并得到高反应性自由基物种II与铁血红素酶。随后，II与富电子芳烃/杂芳烃进行立体可控的自由基环化反应并产生去芳构化自由基中间体III，III经氧化自由基-极性交叉过程和质子转移便可得到所需的去芳构化产物IV，同时再生亚铁血红素蛋白催化剂。此外，计算研究揭示了工程化金属酶和反应性中间体之间额外氢键相互作用在增强酶活性和对映选择性控制方面的重要性，同时作者发现非离子表面活性剂也可以显著加速低溶解性底物的生物转化。相关成果发表在Nature Chemistry 上，第一作者是付文振博士，共同通讯作者为刘鹏教授和杨扬教授。 

图1. 金属氧化还原生物催化的不对称自由基去芳构化。图片来源：Nat. Chem.

首先，作者选择α-溴酰胺取代的吲哚1a为模板底物、完整的大肠杆菌全细胞为生物催化剂，通过高通量实验对实验室收集的细胞色素酶库进行了初始活性的考察（图2a），结果显示P450自由基环化酶P450_ATRCase1和P450_arc1分别以35%和38%的产率以及49:51 e.r.值得到螺环产物2a；而工程化卡宾转移酶P411-VAC_trans的一种相关变体P411-CIS I263G L437F V87L P248T（“P1”）则能以34%的产率和53:47 e.r.值获得2a；当采用相应的无细胞裂解物作为催化剂，同时外加抗坏血酸钠作为还原剂进行生物转化时，作者发现去芳构化产物2a的对映选择性显著提高（83:17 e.r.）。然后，作者以P1为母体进行定向进化来提高P450自由基去芳构化酶的对映选择性和活性（图2b），通过叠加多轮有益突变，发现最终突变体P1 L181V A78C F437A（P450_rad1）能以90%的产率和97:3 e.r.值获得2a，同时没有观察到6-endo-trig自由基环化产物。在最优条件下，作者对吲哚的底物范围进行了考察（图2c），结果显示5位带有供电子基团（如：甲氧基（2a）和甲基（2b））和吸电子基团（如：氟（2d）、氯（2e）和溴（2f））以及2、4、6和7位带有甲基（2g-2j）的吲哚均能以中等至较好的产率和对映选择性获得相应的螺环产物，其中2e的绝对构型通过X-射线衍射分析得以证实。随后，作者对吡咯底物的催化不对称自由基去芳构化进行了考察，通过对挑选的细胞色素酶库初始活性的考察和定向进化，发展了一组吡咯底物的对映发散性去芳构化酶，如图2d所示：α-溴酰胺取代的吡咯3a在P450_rad2（P411-CIS L75A L181A A82V）的作用下进行反应时能以94%的产率和91:9 e.r.值得到产物(R)-4a（X-射线衍射分析确定其绝对构型），总周转数（TTN）为2320±30；而使用P450_rad3（P411_Diane2 W263I G268A P327T V328A E267L）则能以76%的产率和8:92 e.r.值获得产物(S)-4a，TTN为3230±10。

图2. P450_rad1、P450_rad2、P450_rad3的发现、定向进化及底物范围。图片来源：Nat. Chem.

随后，作者为了拓展该金属酶催化平台的适用范围，进一步考察了苯酚底物的催化不对称去芳构化，以外消旋2-溴-1,3-二羰基取代的苯酚 (rac)-5a为模板底物，对实验室收集的细胞色素酶库进行了初始活性的考察，发现了突变体P2 （P450_arc1 L266H G438T L78C）可以以71:29 e.r.得到去芳构化产物6a；随后以P2为母本进行定向进化，通过叠加四轮有益突变，得到最终突变体P450_rad4（P2 F437P L436A L75F G268P）（如图3a），可以以98%的产率和94:6 e.r.值得到具有相邻季碳-季碳立体中心的螺环产物6a（X-射线衍射分析确定其绝对构型），同时没有观察到6-endo-trig自由基环化产物。在最优条件下，作者考察了对映汇聚式自由基去芳构化反应的底物范围（图3b），结果显示未取代苯酚（6b）、2,6-二取代苯酚（6a和6c）、3,5-二取代苯酚（6f）、单取代苯酚（6g）以及丙酯（6d）和丁酯（6e）取代的苯酚均能兼容该反应，以中等至较好的产率、对映选择性和非对映选择性获得相应产物。

图3. P450_rad4的定向进化和底物范围。图片来源：Nat. Chem.

当进一步将该金属酶催化平台应用到萘酚7a的去芳构化时，作者发现工程化P450变体P411-CIS T438S（P450_rad5）具有较好的对映选择性控制（89:11 e.r.），但产率较低（9%），作者推测这可能是由于7a在水中的溶解度和分散性极低所导致的。为此，作者将共溶剂从乙醇（产率：9%、e.r.值：89:11）变为具有更好溶解性的DMSO（产率：21%、e.r.值：91:9），进一步提高了产物8a的产率和对映选择性，但是提高共溶剂的比例并未进一步改善反应的产率。随后作者设想通过向催化体系中加入表面活性剂形成纳米胶束，其疏水中心可以很好容纳疏水底物，有可能进一步提高疏水底物的有效浓度，从而解决溶解度低的问题。对六种非离子表面活性剂进行评估后（图4），作者发现非离子表面活性剂（2 wt%）的加入确实提高了全细胞生物催化7a的不对称去芳构化的催化活性，其中生育酚衍生的表面活性剂TPGS-1000效果最好（产率：71%、e.r.值：92:8）；当采用无细胞裂解物进行生物转化时可进一步提高7a不对称去芳构化的产率（84%）和对映选择性（97:3 e.r.）。综上，这些结果证实了非离子表面活性剂形成的纳米胶束对低溶解性疏水底物在全细胞生物催化和细胞裂解物生物催化中的显著加速效应。

图4. 胶束催化。图片来源：Nat. Chem.

为了深入了解这种生物催化自由基去芳构化过程的对映选择性控制，作者进行了分子动力学（MD）模拟，结果表明去芳构化中间体的两种对映体(S)-10a和(R)-10a在P450_rad1活性位点内表现出完全不同的结合模式。虽然(S)-10a和(R)-10a的N-iPr基团都更倾向于朝向A82和A264旁边的疏水口袋，但吲哚的极性N-H基团却朝向不同的方向。如图5a所示，在酶-(S)-10a复合物中（主要形成(S)-2a），N-H键与T438的羟基形成强氢键相互作用，这种氢键作用通过较短的N-H^sub⋯O^T438距离（3.3 Å）以及分子力学广义玻恩表面积（MM-GBSA）底物-残基相互作用能计算得到了证实。随后，这种氢键相互作用进一步将反应中间体锚定在活性位点，从而增强了自由基去芳构化酶P450_rad1的对映选择性控制。而在酶-(R)-10a复合物中，由于N-H部分指向非极性残基L75，因此不存在氢键相互作用，这表明P450_rad1无法通过氢键作用稳定对映体中间体(R)-10a，这也与实验结果相一致：催化不对称去芳构化得到的产物主要构型为(S)-2a（来自具有氢键稳定作用的(S)-10a）。其次，为了验证T438的作用，作者通过定点突变获得了P450_rad1 T438X突变体并评估其活性和对映选择性（图5b），带有羟基的S438可以作为类似于T438的氢键供体，而A438缺乏氢键供体。事实上，当T438被S438取代时，活性和对映选择性均有所降低（产率：41%、e.r.值：85:15），而当T438被A438取代时，活性和对映选择性显著降低（产率：27%、e.r.值：73:27）。这些结果支持了T438的羟基通过氢键相互作用与底物结合时的关键作用，也再次揭示了双功能酶催化机制是进一步提高酶催化非天然反应的催化效率和立体选择性的一种通用策略。

图5. 对映选择性的起源。图片来源：Nat. Chem.

最后，为了进一步显示该金属酶催化不对称自由基去芳构化的实用性，作者使用无细胞裂解物以0.5–1.0 mmol规模进行制备规模的放大反应，并进一步对去芳构化产物进行了衍生化。对于萘酚底物7a，以98%的产率和96:4 e.r.值分离得到(R)-8a，其可以经Pd/C还原C=C双键得到酮11（产率：99%、e.r.值：98:2），也可以用NaBH₄选择性还原α,β-不饱和酮的羰基，从而以定量产率、>95:5 d.r.值和98:2 e.r.值获得相应的手性醇12（图6a）。相比之下，(S)-2e则以44%的产率和90:10 e.r.值获得（图6b），其可以经Pinnick氧化以定量产率和90:10 e.r.值获得羟吲哚(S)-13，也可以经铜催化的加成反应得到(2S,3S)-14（产率：75%、d.r.值：>95:5、e.r.值：90:10）。

图6. 后期转化。图片来源：Nat. Chem.

总结

本工作利用非天然金属氧化还原生物催化策略，成功地实现了工程化细胞色素P450_rad催化α-卤代羰基取代的吲哚、吡咯和酚的不对称自由基去芳构化反应，以良好至优异的产率和对映选择性制备了一系列具有相邻季碳-季碳立体中心的螺环产物。此外，计算研究揭示了工程化酶与反应中间体之间额外氢键相互作用在增强酶活性和对映选择性控制方面的重要性，同时作者发现非离子表面活性剂也可以显著加速这种生物转化。总的来说，这种可进化的金属酶催化平台为推进涉及自由基中间体且极具挑战性的不对称去芳构化过程的研究开辟了新途径。

杨扬教授课题组从事生物催化、酶的设计与改造相关研究。欢迎对生物催化感兴趣的研究生和博士后申请者与杨扬教授联系。邮件：yang@chem.ucsb.edu

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

A metalloenzyme platform for catalytic asymmetric radical dearomatization

Wenzhen Fu, Yue Fu, Yunlong Zhao, Huanan Wang, Peng Liu, Yang Yang

Nat. Chem., 2024. DOI: 10.1038/s41557-024-01608-8

导师介绍

杨扬

https://www.x-mol.com/university/faculty/369148 

刘鹏

https://www.x-mol.com/university/faculty/1732 

（本文由吡哆醛供稿）