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Flavin-N5OOH:黄素酶超家族中的强亲核试剂和强碱

近日,厦门大学化学化工学院王斌举教授(点击查看介绍)课题组在Angewandte Chemie International Edition 期刊上在线发表研究论文,该论文采用多尺度理论计算方法(包括分子动力学模拟MD、QM/MM-MD、QM/MM和QM计算等),揭示了RutA和EncM两种黄素酶中的氧气活化机制,并发现Flavin-N5OOH作为这两类酶中共同的活性物种参与催化反应。


黄素酶是一类不需要金属但是需要辅因子去帮助实现氧气活化的一类酶,它们的辅因子为FMN(黄素单核苷酸)或者是FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)。通常,在黄素单加氧酶或氧化酶中,O2活化发生在黄素辅因子的 C4a 位点,形成黄素 Flavin-C4aOO(H)作为活性物种去催化一系列氧化反应。最近,在EncM 和RutA酶中均检测到Flavin-N5O物种的存在,这引发了大家对黄素N5位点的思考(图1)。

图1. 黄素酶中可能的催化活性物种


在RutA酶中,作者首先通过QM计算评估了Flavin-N5OO形成的两种可能路径。结果表明,Flavin-N5OO物种的形成在生理条件下是很难的。之后,作者使用 QM 模型测试Flavin-C4aOO(H)作为活性物种介导RutA酶催化尿嘧啶C−N键裂解的可能性,结果表明这个过程同样具有挑战性。


在排除了Flavin-N5OO和Flavin-C4aOO(H)介导RutA酶催化尿嘧啶C−N裂解反应发生的可能性之后,作者使用 QM/MM 计算探索了 Flavin-N5OOH的形成机制(图2)。研究表明氧气分子通过HAT(氢原子转移)过程攫取FMNH上的氢原子,形成FMNH•−/OOH(3INT1)。之后经过自旋翻转和自由基偶联形成Flavin-N5OOH物种(1INT2)。形成1INT2之后,通过MD和QM/MM-MD模拟表明,底物会发生构象旋转,这将导致底物的目标碳更加靠近Flavin-N5OOH的远端O1,有利于后续的亲核进攻过程。随后Flavin-N5OOH对底物的羰基碳(C4)进行亲核进攻(能垒仅需1.6 kcal/mol)形成1INT3。之后会发生快速的C−N键断裂以及分子内质子转移过程,释放出最终的产物1P和Flavin-N5O物种。

图2. RutA酶中,Flavin-N5OOH的形成和Flavin-N5OOH介导尿嘧啶C−N键的裂解反应机制


随后,作者通过QM/MM计算进一步探究了Flavin-N5OOH在EncM酶中的作用。结果表明,Flavin-N5OOH能够作为碱夺取底物羟基上的质子(H6),形成去质子化的底物和Flavin-N5O,这一步仅需要克服6.9 kcal/mol的能垒,并且放热35.5 kcal/mol。这说明Flavin-N5OOH作为碱去实现底物去质子化的过程在动力学和热力学上都是非常有利的。最后Flavin-N5O能够氧化底物形成C4-酮物种P''。

图3. 在EncM酶中,Flavin-N5OOH介导底物去质子化的反应机制


在明确了Flavin-N5OOH的作用之后,作者使用簇-连续介质模型计算比较了水溶液中 OH(OH离子被认为是化学中最强的亲核试剂之一)催化的尿嘧啶水解过程。计算结果表明,Flavin-N5OOH 物质中的OH与 Flavin-N5O 物质弱键合,这使得 Flavin-N5OOH 物质在亲核加成反应中具有高反应性。


最后,作者认为Flavin-N5OOH可以作为一个普遍的催化活性物种介导黄素酶中各种底物的C−X(X=N、S、Cl、O)键的裂解。除了RutA 催化的尿嘧啶的C−N裂解外,还可能包括黄素酶 DszA 催化的二苯并噻吩砜的 C−S 键裂解,黄素依赖性脱卤反应,以及FAD和NADH介导的非典型角环素Fluostatins(FSTs)的环氧基团开环反应。并且,这些类型的反应都得到了作者 QM 模型计算的支持。

图4. 溶剂中OH亲核进攻尿嘧啶的机制和Flavin-N5OOH 介导底物C−X (X=N, S, Cl, O)裂解的催化机制


综上,作者进行了大量的计算研究来阐明RutA酶催化尿嘧啶C−N裂解和 EncM催化C4-酮化反应的活性物种。研究表明,Flavin-N5OOH是RutA和EncM酶中常见的活性物种。在RutA酶中,Flavin-N5OOH物种作为强亲核试剂,介导尿嘧啶的选择性C−N裂解,而在EncM酶中,它作为实现底物选择性去质子化的有效碱。Flavin-N5OOH物种能够实现水溶液中“OH”难以实现的活性和选择性。作者认为Flavin-N5OOH不仅可以作为超强碱介导底物的选择性去质子化过程,也可以作为强亲核试剂介导底物 C–X (X=N, O, S, Cl) 键的断裂。这项发现显著拓宽了人们对黄素酶中氧气活化以及催化机理的认识。


这一成果近期发表在Angew. Chem. Int. Ed.上,厦门大学化学化工学院王斌举教授和以色列希伯来大学Sason Shaik教授为论文共同通讯作者,第一作者为厦门大学2022级博士生张巧玉


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Flavin-N5OOH Functions as both a Powerful Nucleophile and a Base in the Superfamily of Flavoenzymes

Qiaoyu Zhang, Qianqian Chen, Sason shaik*, Binju Wang*

Angew. Chem. Int. Ed.2024, DOI: 10.1002/anie.202318629


导师介绍

王斌举

https://www.x-mol.com/university/faculty/243303 


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