Nature：[¹⁸F]二氟卡宾解锁正电子放射断层扫描

自Curtius和Staudinger在卡宾方面作出的开创性工作以来，卡宾便在有机化学和有机金属化学方面发挥着重要的作用，同时还在生物、医药和材料科学等领域得到了广泛的应用。不过，在核科学领域——更具体地说——正电子发射断层扫描（PET）方面，放射性标记形式卡宾的合成却甚少涉及（图1a）。正电子发射断层扫描利用放射性示踪剂来跟踪体内复杂的生物过程，并凭借其高分辨率和高灵敏度广泛应用于临床诊断和药物开发等，而放射性标记通常使用一系列发射正电子的放射性核素，例如具有优异性能的[¹⁸F]（97% β⁺衰变，半衰期109.8 min，正电子能量635 KeV）。目前，正电子发射断层扫描的一个重要指标是高摩尔活性（Am），通过回旋加速器产生的[¹⁸F]氟化物是实现这一重要指标的最佳方法。尽管[¹⁸F]放射化学取得了一定的进展，但要想构建[¹⁸F]标记的多氟烷基化分子仍颇具挑战，这是因为[¹⁸F]标记所使用的氟化前体中会浸出¹⁹F氟化物，从而导致Am低等问题。近年来，化学家利用[¹⁸F]氟化物并通过金属介导和自由基策略实现了[¹⁸F]-三氟甲基化。然而，对成像效果较好的[¹⁸F]标记的二氟甲基化的合成方法却十分有限，并存在合成产物摩尔活性较低和合成路线较长等问题。

相比之下，二氟卡宾（:CF₂）作为一种活性中间体，可实现多种化学反应，例如：X-H键（X = O, N, S等）的插入反应、不饱和键的[2+1]环加成以及交叉偶联反应等。遗憾的是，有关[¹⁸F]二氟卡宾（[¹⁸F] DFC）的研究却寥寥无几。近日，英国牛津大学的Véronique Gouverneur教授课题组设计开发了一种可用于¹⁸F标记的二氟卡宾生成试剂，后者可在温和条件下实现O-H、S-H 和 N-H键的插入，从而成功地对酚、硫酚、含氮杂环、醇类以及芳基硼酸等底物进行¹⁸F二氟甲基化标记，为PET分子成像试剂及其应用提供了新的机会。相关成果发表于Nature 上。

图1. 研究背景。图片来源：Nature

最初，作者以¹⁹F/¹⁸F交换策略来原位生成DFC，但是效果不佳，因此作者希望借助¹⁸F标记试剂来引入DFC标记，并从候选者的挥发性（如HCF₃、ClCF₂H）和难以处理、纯化及表征的盐（如ClF₂CO₂Na、Ph₃P⁺CF₂CO₂^-）等方面排除氟化试剂。另一方面，基于氧、硫和氮等亲核试剂直接实现¹⁸F-二氟甲基化的需求，作者选择在碱性条件下释放[¹⁸F]DFC试剂，以此来活化含有杂原子的亲核试剂并实现插入反应。如图1b所示，作者选择[¹⁸F]标记的1-(叔丁基)-4-(二氟甲基)磺酰基)苯（1b）为DFC前体，后者是通过(溴氟甲基)-(4-(叔丁基)苯基)硫烷（2b）与[¹⁸F]氟化物的亲核取代，随后再用 RuCl₃/NaIO₄进行氧化获得，活性产率（AY）为10%±2% (n=5)。最值得注意的是，[¹⁸F]1b和模板底物苯酚可在KOH条件下进行反应，并以72%的放射化学产率（RCY）获得[¹⁸F]3，这表明此条件下发生了 [¹⁸F]DFC释放和O-H键插入。此外，还可以在TRASIS AllinOne平台上实现[¹⁸F]1b的辐射合成，并且在72 min的总合成时间内n.d.c活性产率高达6%，A_m= 10 ± 0 GBq/µmol (n = 2)。

其次，作者利用密度泛函理论（DFT）计算来揭示[¹⁸F]DFC在碱性条件下的释放机制、O-H键插入以及[¹⁸F]1上苯基取代基的影响。研究结果表明：1）1a是通过逐步α-消除来形成DFC（图1c）；2）当1a对位带有缺电子基团时反应活性高，并且对位取代基在优化A_m方面具有灵活性。另外，[¹⁸F]1b还能分别与1,1-二苯基乙烯和苯乙酮进行反应并得到相应的产物[¹⁸F]4和[¹⁸F]5，这表明[¹⁸F]1既可以作为[¹⁸F]DFC前体，也可以[¹⁸F]CF₂H阴离子的替代物；3）与氟化物相比，氢氧化物作为亲核试剂易与2b发生S_N2反应，因此导致[¹⁸F]1b的A_m值低；4）在¹⁸F掺入的条件下未观察到砜1b的¹⁹F/¹⁸F同位素交换，而在无外加氟源的情况下，2b与K_2.2.2./K₂CO₃的反应可得到(4-(叔丁基)苯基)(二氟甲基)硫烷6b（图1d）；5）对位上五种不同基团取代的DFC前体2也可与K_2.2.2./K₂CO₃反应获得相应的硫化物6（图1d），并且产率按照以下顺序递增（即Cl~NO₂ < ^tBu < H < OMe），这表明对位带有氯或硝基时可减少¹⁹F-氟化物的浸出，从而增加A_m值；6）在[¹⁸F]氟化物（起始活性为135-148 GBq）的存在下，[¹⁸F]1d的A_m值最高（A_m=131±29 GBq/µmol (n = 2)）。

图2. 底物拓展。图片来源：Nature

随后，作者以[¹⁸F]1b和[¹⁸F]1d为[¹⁸F]DFC前体，对该反应的底物范围进行了考察。如图2所示，一系列不同基团（如烷氧基、酮羰基、烷基、酯基、卤化物、氰基、硝基、磺酰胺、醛羰基、氨基等）取代的（杂）芳基酚均能兼容该反应，以27%-88%的RCY获得相应的¹⁸F标记产物（[¹⁸F]3、[¹⁸F]6-23）。值得一提的是，[¹⁸F] DFC还可以实现S-H键和N-H键的插入，无论是缺电子、富电子以及电中性的（杂）芳基硫酚（[¹⁸F]25-29）还是氮杂环底物（如苯并咪唑[¹⁸F]30、(1H-苯并咪唑-2-基)甲醇[¹⁸F]31、1H-吲唑[¹⁸F]32、苯并三氮唑[¹⁸F]33）均能有效地实现这一转化，并以中等至较好的RCY获得所需产物。

另外，该方法对于药物分子以及复杂生物活性分子的后期修饰同样适用（图3），例如：¹⁸F标记的抗炎药罗氟司特以及八种 [¹⁸F]OCF₂H 和 [¹⁸F]NCF₂H 药物类似物（[¹⁸F]34-40）、PET 放射性配体 P2X7R、PMB 保护的 PF-06809247、DASA-23、MPC6827、DPA-714 和伊潘立酮的 [¹⁸F]OCF₂H 类似物（[¹⁸F] 41-46）。对于不含有苯酚官能团的药物类似物（如非诺贝特、FMTEB、N-Boc-氟西汀、苯丙氨酸、氟他胺、依托考昔）而言，作者从芳基硼酸前体出发，经硼酸氧化-¹⁸F二氟甲基化一锅法实现了¹⁸F标记（图3b），从而以中等至良好的RCY (22%-86%) 得到相应的产物（[¹⁸F]47-52）。值得一提的是，作者还从[¹⁸F]氟化物出发一锅法实现了[¹⁸F]46的简短合成，得到 2% AY 和 >99% 放射化学纯度的产物[¹⁸F]46（总合成时间135 min），并且与[¹⁸F]氟化物直接制备的临床相关 [¹⁸F]UCB-J 获得的 AY 相当。最后，作者使用 FCH₂CH₂O 取代的[¹⁸F]DPA-714 及其 OCF₂H 类似物 [¹⁸F]46对C57BL/6J 小鼠进行了体内研究，结果显示注射[¹⁸F]46 5 min后的小鼠血浆和脑组织匀浆提取物中没有基于放射性-HPLC的代谢物，这与[¹⁸F]DPA-714形成了鲜明的对比，证实了OCF₂H的代谢稳定性。另外，[¹⁸F]46还可成功地对亨廷顿病喹啉酸病变模型纹状体中的小胶质细胞活化进行成像，这进一步证明了该[¹⁸F]DFC方法在（前）临床 PET 研究中的效用。

图3. [¹⁸F]OCF₂H和[¹⁸F]NCF₂H适用范围。图片来源：Nature

最后，作者利用过渡金属配合物来捕获和转移源自 [¹⁸F]1b 和 [¹⁸F]1d 的 [¹⁸F]DFC以实现芳烃的位点选择性¹⁸F-二氟甲基化。具体而言，作者选择4-联苯硼酸为模板底物进行条件优化，结果显示在Pd₂dba₃（2.50 µmol）、Xantphos（7.50 µmol）、氢醌（50 µmol）、KOH（aq，40 µL）的1,4-二恶烷（1.0 mL）溶液中于130 °C下进行反应，以45%的RCY获得相应的¹⁸F标记产物[¹⁸F]53。对照实验表明在没有Pd 或氢醌的条件下进行反应时，[¹⁸F]53无法形成或者RCY 显著降低。在此基础上，作者对芳基硼酸的底物范围进行了考察（图4），结果显示不同基团取代的芳基硼酸（[¹⁸F]54、[¹⁸F]55、[¹⁸F]57-59、[¹⁸F]62-64）以及杂环硼酸（[¹⁸F]56、[¹⁸F]58、[¹⁸F]60、[¹⁸F]61）均能兼容该反应，以良好的RCY得到相应的¹⁸F标记产物。另外，该方法还能实现药物分子和复杂分子的后期修饰，例如：非诺贝特（[¹⁸F]63和[¹⁸F]47）、FMTEB（[¹⁸F]64和[¹⁸F]48）、N-Boc-氟西汀（[¹⁸F]65和[¹⁸F]49）以及受保护的苯丙氨酸（[¹⁸F]66和[¹⁸F]50)均能获得相应的[¹⁸F]CF₂H。

图4. [¹⁸F]ArCF₂H底物范围。图片来源：Nature

总结

Gouverneur教授课题组设计开发了一种可用于¹⁸F标记的二氟卡宾生成试剂，在温和条件下实现了酚、硫酚、含氮杂环、醇类以及芳基硼酸等广泛底物的¹⁸F二氟甲基化标记。该方法不仅具有条件温和、底物适应性强等优点，而且对于药物分子和复杂生物活性分子的后期修饰具有重要的意义，并为PET分子成像试剂、疾病诊断和药物研发提供了新的机会。

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 [¹⁸F] Difluorocarbene for Positron Emission Tomography

Jeroen B. I. Sap, Claudio F. Meyer, Joseph Ford, Natan J. W. Straathof, Alexander B. Dürr, Mariah J. Lelos, Stephen J. Paisey, Tim A. Mollner, Sandrine M. Hell, Andrés A. Trabanco, Christophe Genicot, Christopher W. am Ende, Robert S. Paton, Matthew Tredwell, Véronique Gouverneur

Nature, 2022, DOI: 10.1038/s41586-022-04669-2

（本文由吡哆醛供稿）