ACS Catal.：理论计算揭示环化酶XimE催化的二分杂合特性

注：文末有研究团队简介及本文科研思路分析

催化的专一性和高效性被认为是生物催化剂酶的重要特性，但在厦门霉素合成途径中发现的Snoal-like环化酶XimE不但能催化S-构型的天然环氧代谢物发生吡喃环化反应，而且可以催化对映异构体R-构型的非天然环氧化物发生呋喃环化反应，展现了环化酶XimE独特的二分杂合催化特性。近日上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室赵一雷教授团队在美国化学会ACS Catalysis 在线发表研究论文，通过理论酶簇模型、预反应态等MD模拟、ONIOM理论计算和QM/SCRF(VS)介电常数扫描揭示了环化酶XimE催化这一对对映异构环化物分别合成苯并杂环衍生物吡喃香豆素和呋喃香豆素的微观过程。在两条催化途径中，吡喃环化倾向酸式模式，其过渡态为融合型（“fused-”）；而呋喃环化倾向碱式模式，过渡态呈现螺型（“spiro-”）。ONIOM计算发现从两个预防态出发可形成四种过渡态结构，其相对能量顺序为Fused-S ≲ Spiro-S < Spiro-R < Fused-R。XimE展示出的对底物控制的催化化学区域偏好性与诱导契合作用密切相关。

1. 底物结合与理论酶簇模型

研究发现S-构型底物和R-构型底物与酶结合模式极为相似，皆为底物疏水尾端伸入到蛋白疏水口袋当中，而底物苯甲酸头部由蛋白亲水出口的Y153及R76氢键和盐桥锚定，反应位点的氧环与酚羟基分别与蛋白口袋中部的E136-Y46和H102残基形成催化性氢键。理论酶簇模型表明环氧开环机制为Brønsted 酸碱催化或广义酸碱催化。在非酶催化条件下酸式催化下的优势路径为吡喃环化反应，而碱式催化下的优势路径为呋喃环化反应。广义酸碱催化模型则说明E136-Y46和H102的共轭酸碱形式即可作为质子供体也可以作为质子受体。

图1. 晶体结构中底物与酶的结合方式展示：上下视图和活性口袋处放大视图，以及可能的酸碱催化S-和R-构型环氧底物的结合模式。图片来源：ACS Catal.

2. 预反应态分析

进一步预反应态分子动力学模拟表明，形成主产物的fused-S和spiro-R预反应态在轨迹中活性构象布居数分别高达到66.5%和83.4%，而副产物的spiro-S和fused-R预反应态活性构象布居数仅占2.2%和2.1%。其差异主要是由于spiro-S预反应态中的环氧基O与H102-Nε之间以及fused-R预反应态的酚羟基O与E136-Oε之间不能形成稳定氢键。

图2. 预反应态分子动力学模拟：底物环氧O分子和酚羟基O原子与H102-Nε和E136-Oε的距离统计（蓝色,fused-S,红色，spiro-R,绿色，spiro-S,橘色，fused-R），以3Å为阈值统计预反应态占比。图片来源：ACS Catal.

3. QM/MM过渡态结构

QM/MM计算在oniom (ωB97X-D/6-31+G(d):amber) 水平进行，重点比较了优势预反应态衍生出的“fused-S”、“spiro-S”、“spiro-R”、“fused-R”四个过渡态结构。在S环氧底物体系中两个过渡态尾端疏水异戊烯基差异在0.2Å以内而在R环氧底物体系中二者位置差异达1.7 Å。受R76盐桥作用的约束，四个过渡态的苯甲酸头部位置几乎一致，差异在0.6 Å以内。过渡态结构中异戊烯基尾端与A50接近，A50的C_B原子到底物C6/C7原子的距离分别从3.75和3.65 Å缩小到3.05和3.30 Å，导致尾端的活动受到限制。结构比较表明L75、F93、V97、V120形成的疏水口袋限制了底物的自由空间，对非优势路径的fused-R-TS显示出了明显的空间排斥效应。

图3. oniom(ωB97X-D/6-31+G(d):amber)优化的过渡态结构：（A）S环化底物体系，（B）R环氧底物体系。图片来源：ACS Catal.

QM/SCRF(VS)计算表明酶催化口袋疏水性对反应势能面有较大的影响，介电常数ε从2.0~8.0的变化过程中反应能垒变化较小, 但反应能变化显著：从真空条件下的吸热反应转变为疏水环境下的轻微吸热反应，并且随着环境亲水性上升而提高放热。

表1. MD-QM/SCRF(VS)，ε= 2.0，4.0，6.0，8.0 时的能量统计。表格来源：ACS Catal.

过渡态-酶复合物的动态分析表明形成主产物的过渡态与活性口袋的结合比副产物的更为稳定。XimE的化学区域选择性源自底物与酶结合产生的诱导契合效应以及E136-H102的广义酸碱催化分子机制。

图4. 过渡态Rg-RMS图及过渡态的叠合分析。图片来源 ACS Catal.

XimE催化的环氧开环反应反应总结如下：

(1) 米氏复合物形成：S-环氧底物形成融合型预反应态结构，而R-环氧底物形成螺型预反应态。

(2) S-环氧化物主过渡态为与预反应态匹配的融合型过渡态，而R-环氧化物的主过渡态也与预反应态匹配的螺型过渡态。

(3) S-环氧化物底物形成 (2S,3R)-吡喃环化产物，R-环氧化物底物形成 (2R,3S)-呋喃环化产物，XimE在催化两种底物时具有明显的化学区域选择性。

(4) 产物释放是由疏水袋中质子化 H102 和去质子化 E136之间的酸碱中和驱动的。当酶释放产物分子时，H102-E136 通过质子转移后又进入新的催化循环中。

图5. XimE酶催化吡喃和呋喃生成的循环反应。图片来源：ACS Catal.

上海交大生命科学技术学院硕士生蒋础础、贺贝贝分别为第一和第二作者，徐岷涓教授、赵一雷教授和美国加州大学洛杉矶大学Houk教授为共同通讯作者，上海交通大学生命科学技术学院为第一署名单位/通讯单位。该工作得到了国家重点研发计划、自然科学基金面上项目、教育部代谢与发育科学国际合作联合实验室的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Computational Exploration of How Enzyme XimE Converts Natural S-Epoxide to Pyran and R-Epoxide to Furan

Chuchu Jiang, Bei-Bei He, Rosalinda L. Zhao, Min-Juan Xu*, K. N. Houk*, and Yi-Lei Zhao*

ACS Catal., 2021, 11, 7928–7942, DOI: 10.1021/acscatal.1c01335

赵一雷教授简介

上海交通大学教授，聚焦计算生物化学研究，如DNA磷硫酰化引起的双螺旋结构微扰和化学性质变化、生物合成酶和工业酶突变的反应势能面与催化效能关系。在JACS、ACS Catalysis等化学主流期刊上发表了百余篇SCI论文，获UCLA优秀博士后、上海市浦江人才和东方学者、教育部新世纪优秀人才等奖励。

https://www.x-mol.com/university/faculty/71512 

科研思路分析

Q：这项研究最初的目的是什么？或者说想法是怎么产生的？

A：这项研究最初来自于一个意外的实验现象，贺贝贝同学在用人工合成消旋底物做酶催化实验时发现XimE不仅能够催化S-构型的天然底物生成吡喃环而且同时能够催化非天然R-构型的环氧化物生成呋喃环，展现了XimE独特的杂合催化特性，我们对这一现象的内在机制十分感兴趣，由于与课本中对酶的专一性相违背，其中的分子机制可能对理解酶分子进化的特异性跳跃转变特别重要。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：由于环氧底物在化学上的不稳定，很难用实验方法研究其机制，正好是计算模拟可以大展身手的地方，所以就开始了这项研究。在2019年发表的工作中提出了XimE的初步催化机制，里面很多细节还是模糊的，比如E136和H102以及Y46的具体角色以及缺乏高阶量子力学的整体计算，为了搞清楚实验中发生的微观细节我们尝试了几乎所有的可能反应途径，计算体系过多也给后期的结果分析增加了难度。特别是如果从理论酶模型来看，非酶开环反应中酸式催化为吡喃环化而碱式催化为呋喃环化；因此课题开始的时候一直认为XimE的两条酶催化途径也分别为酸式和碱式的差别，但是完成了酸碱催化的全部可能途径计算后，才发现不同手性环氧底物遵循相近的广义酸碱催化分子机制——仅仅是吡喃环化稍微偏好广义酸的模式而呋喃环化稍微偏好广义碱的模式，从两个优势预反应态出发的二分岔反应势能面的途径选择因素主要是来之酶疏水口袋的动态结构和底物环化时不同旋转模式的内能变化。