Science：手性磷酸介导寡核苷酸的立体发散性合成

环二核苷酸（cyclic dinucleotides，CDNs）是一类天然的环状RNA分子，其异二聚体2',3'-环鸟苷单磷酸-腺苷单磷酸（cGAMP）能够通过激活干扰素刺激蛋白（STING）来引发免疫应答（图1A），有望用于肿瘤治疗，目前已有多项相关的临床研究正在进行中。对天然磷酸二酯键进行化学修饰（如与硫代磷酸酯（PS）进行交换）是制备代谢稳定性和治疗潜力更高的小分子疗法的有效策略，但是会导致其中的磷原子存在立体中心。因此，PS衍生的CDN存在四种可能的非对映异构体，且每种CDN的生物活性和物理特性都不同。这些CDN衍生物大多都依赖非选择性合成，后者通常需要繁琐的反相高效液相色谱（HPLC）纯化才能分离出少量的非对映异构体纯产物。目前，合成PS修饰的寡核苷酸的最通用方法是使用市售的P(III)-亚磷酰胺和化学计量的活化剂，以提供2ⁿ个非对映异构体的随机混合物。因此，使用手性助剂是建立可靠立体控制的唯一可行选择（图1B）。但是，这些策略需要多步合成来准备和安装辅基，并且会产生化学计量的副产物。

相比之下，不对称催化很有希望能解决这些问题。然而，目前尚未报道过基于P(III)选择性转移的不对称催化。近日，美国耶鲁大学化学系的Scott J. Miller教授和日本武田制药的David K. Leahy等研究者使用手性磷酸（CPA）介导的偶联合成了立体化学确定的二核苷酸，实现了P(III)选择性转移的不对称催化（图1C），并且首次证明了CPA催化剂可控制亚磷酰胺转移过程中磷手性中心的形成（图1D）。事实证明两种不同的CPA骨架对于立体差异的实现至关重要：肽嵌入的磷酸苏氨酸（pThr）衍生的CPAs倾向于固有的底物偏好，而C2对称的BINOL衍生的CPAs则完全颠覆了这种立体化学偏好。相关成果发表在Science 上。

图1. 研究背景及反应发展。图片来源：Science

近年来，作者开发了肽嵌入的磷酸苏氨酸（pThr）作为新型的CPA催化剂。为了评估这些CPAs影响不对称磷酸化的能力，作者从鸟苷亚磷酰胺1 [~3：1dr]和腺苷衍生物2（图2A）的2'到5'偶联开始探索。事实上，简单的磷酸都能催化1和2的偶联，提供P(III)二核苷酸中间体，然后用t-BuOOH对其进行立体保持氧化，便可得到所需的立体异构磷酸酯3。于是作者考察了两类CPAs，并将结果与二苯基磷酸（DPP）进行了比较，后者是一种非手性催化剂，用于标定手性底物固有的选择性。结果显示pThr衍生的催化剂倾向于β-转向结构且对i+1和i+2位置分别具有^DPro和Aib的催化剂表现出了选择性（图2A）。值得一提的是，催化剂P3（20 mol％）能以77％的收率和85：15 dr值得到产物，扩增了S_P非对映异构体（相对于DPP获得的77:23 dr）。对催化剂结构的进一步修饰并未导致选择性（P4-P8）的大幅增加。但是，将反应浓度降低到0.04 M时，选择性能提高到91：9 dr；将反应温度降低至4 ℃时，能以79%的分离收率和94∶6的dr值得到目标产物。此外，将反应放大至0.05 mmol规模时，仍能以67％的收率和88:12 dr值得到产物。

鉴于P-立体异构性对基于寡核苷酸治疗剂的功效有重大影响，作者寻求了一种互补的、立体发散的磷酸催化剂——基于C2对称BINOL骨架的CPA。最初，作者在标准反应条件下对（R）-TRIP（B1）进行了评估，以26％的收率和45:55 dr值获得了二核苷酸3（图2B），且略微偏向于R_P非对映异构体。当使用（S）-B1作为催化剂时，收率和选择性均显著提高（收率：74％；dr 值：8:92）。经过一系列筛选，发现（S）-B7效果最好（收率：63%；dr 值：1:99），而（R）-B7的选择性则较差（43:57 dr），但仍能提供R_P非对映异构体。这些结果表明两种不同的催化剂骨架（pThr和BINOL衍生的CPA结构）使得不对称亚磷酰胺偶联表现出显著的立体发散性。

图2. 反应条件优化。图片来源：Science

类似于1H-四唑机理，作者认为磷酸催化剂在质子向二异丙胺转移的过程中既充当酸，又充当亲核试剂（图1D）。为了验证这一假设并探讨机理，作者通过反相色谱法分离了亚磷酰胺非对映异构体（1，图2C），并将所得的纯亚磷酰胺（1_Fast 和1_Slow）置于各种催化剂（P3、（S）-B7和DPP）的最佳反应条件下。结果显示二核苷酸3的立体化学与1的起始dr值无关，这是因为催化剂能以相同的非对映选择性将1的非对映异构体转化为（R_P）-3或（S_P）-3。

接下来，作者探索了该反应的底物范围（图3）。例如用t-BuOOH处理中间体亚磷酸酯便可得到磷酸酯3，而使用苯乙酰基二硫化物（PADS）进行硫化时便可得到PS 4。值得一提的是，将反应浓度提高到0.40 M时，（S）-B7的负载量可低至5 mol％，并以57%的收率和98：2 dr值得到（S_P）-4。除了异亚丙基腺苷（3），脱氧腺苷（5）和C2'-氟-脱氧腺苷（6）也能很好地耐受该反应，并观察到类似的非对映发散性。当将2'，3'-未保护的腺苷用作亲核偶联配偶体时，在（S）-B7的作用下实现了高位点选择性和非对映选择性的磷酸化，并在单偶联产物的五种可能异构体中选择了一种单一的产物（7）。相比之下，当用DPP作为催化剂时，得到的是复杂的产物混合物（图3B）。其它的核糖核苷（8-10）也可以高产率和选择性与鸟苷1进行偶联，而其它的亚磷酰胺（11和12）与鸟苷1进行偶联时，选择性却降低了。这些结果表明非对映发散性催化可以应用于其它核碱基对。

图3. 底物范围研究。图片来源：Science

为了解决先前方法存在的问题（如化学计量的活化剂、合成效率低），作者以催化剂控制的方式制备了立体纯CDNs。为此，他们使用这种新开发的方法在1和13之间进行立体选择性的亚磷酰胺偶联，然后进行H-膦酸酯大环化以获得具有所需磷立体化学的PS 16（图4）。最初，在优化的条件下，1和13•Et₃N偶联的选择性并不好（图4A）。在没有手性催化剂的情况下显示出快速的非选择性背景反应，这很可能是由于三乙铵阳离子（pK_a（DMSO）= 9.0）促进的自催化作用胜过了催化过程。为了规避这种自催化作用，作者通过离子交换制备了一系列碱金属膦酸盐并评估了它们的效果。当在无催化剂的情况下用13•Na进行反应时，24h后的产率为23％，而13•Et₃N为46％，这表明背景反应被抑制。使用先前优化的催化剂，作者发现选择性取决于抗衡离子和催化剂的结构。当使用pThr催化剂P3时，发现Cs⁺膦酸酯盐对R_P非对映异构体14的选择性最高（10:90 dr）。此外，当使用13的Li⁺盐进行反应时，发现催化剂（S）-B8对S_P非对映异构体的选择性最高（74:26 dr）。由于Li⁺盐在反应条件下的溶解度增加，因此在4 °C下使用MeCN/DMF进一步提高了选择性（77:23 dr）。

为了完成立体纯CDNs的合成，作者在简单的结晶后将1和13•Cs以3.0 mmol规模在P3下进行偶联，分离出>2g的粗制（R_P）-14。然后用三氟乙酸水溶液在C5'处对乙硅烷进行位点选择性水解，在快速色谱分离后以两步30％的收率和1:99 dr值得到大环化前体（R_P）-15。后者在2,6-二甲基吡啶为碱、20 mol％ N-甲基咪唑（NMI）为亲核催化剂、二氯甲烷为溶剂的条件下与二苯基磷酰氯反应，可以21%的分离收率和优异的非对映选择性（> 90:10 dr）得到（R_P，R_P）-16。经整体脱保护后，CDN 2',3'-cG^SA^SMP [（R_P，R_P）-17]通过丙酮结晶，最终以75%的收率分离出单一的非对映异构体。当使用（S）-B8作为催化剂和13•Li反应时，也可以通过相似的顺序以高选择性获得（2'-5'）S_P，（3'-5'）R_P非对映异构体（图4C）。此外，作者通过测量HPLC洗脱顺序确定了（R_P，R_P）-17和（S_P，R_P）-17中磷的相对立体化学构型。也就是说，肽衍生的催化剂P3选择（R_P）构型的PS，而BINOL衍生的催化剂（S）-B7和（S）-B8选择（S_P）构型的PS。因此，类推地确认了2'，5'-连接的二核苷酸底物（3-10和12）的相对构型（图3）。

图4. 克级规模CDN的合成。图片来源：Science

总结

本文报道了基于肽骨架和C2对称BINOL衍生骨架的CPAs催化的磷酰胺偶联反应，并充分控制了P（III）的立体化学。这些催化剂还能用于CDNs的立体控制合成，从而实现了这些化合物的简洁合成。总体而言，每一类催化剂以及CPA框架本身都明确提供了一种新的催化方法，用于合成P-立体异构核苷酸衍生物，具有重要的应用价值。

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Catalytic asymmetric and stereodivergent oligonucleotide synthesis

Aaron L. Featherston, Yongseok Kwon, Matthew M. Pompeo, Oliver D. Engl, David K. Leahy, Scott J. Miller

Science, 2021, 371, 702-707, DOI: 10.1126/science.abf4359

导师介绍

Scott J. Miller

https://www.x-mol.com/university/faculty/1299