香港大学孙红哲教授课题组近年来重要工作概览

孙红哲，香港大学化学系讲座教授、叶志成•范港喜基金教授。长期从事（无机）化学与生物、医学交叉领域的研究，在金属的化学生物学、金属蛋白的结构与功能及金属铋类药物作用机理研究方面做出了系统、完整的工作。近年来，孙教授的研究涵盖了抗耐药菌药物及抗病毒药物的研发、金属（蛋白质）组学方法的开发、分子探针合成、机器深度学习等诸多领域。这些研究不仅具有重要的学术价值，而且对新型无机药物的设计及用途的开发也具有深远意义。

孙教授曾于1990-1993年任职南京大学配位化学研究所，1996年获伦敦大学博士学位。1998年加盟香港大学化学系，2018年任香港大学讲座教授和叶志成•范港喜基金教授（生物无机化学）。他2011年获得香港“裘槎高级研究成就奖”，2016年药明康德“生命化学研究奖（‘学者奖’）”，2018年美国加州大学•伯克利 ‘Earl L Muetterties Memorial Lectureship’讲座奖。孙教授的研究成果已发表在Nature Microbiol., Nature Mach. Intell., Nature Commun., Proc. Natl. Acad. Sci., JACS, Angew. Chem.等国际著名期刊上，并主编《砷、锑、铋的生物化学》英文著作（Wiley, 2011）。

孙红哲教授。图片来源：香港大学

本文选取孙红哲教授课题组发表的几篇代表性文章来简要介绍孙教授近年来在生物无机和化学生物学领域所取得的杰出成果。

一、研发金属药物克服超级细菌耐药性

2008年于印度出现的新德里内酰胺酶（NDM-1）是一种寄存于细菌中的耐药因子，能够在细菌内水解用于治疗严重细菌感染或多重耐药菌感染最主要药物之一的碳青霉烯（Carbapenem）类抗生素，从而使相关的抗生素对细菌失去活性，导致治疗失败。目前临床上常用抗生素与耐药因子抑制剂的联合疗法对耐药细菌感染进行治疗，但现今尚未有针对此类产NDM-1及相关的其他金属β内酰胺酶的耐药菌的抑制剂在临床上获批使用，因此如何找到一种经济、有效、副作用小的替代性疗法，是科学家和临床医学家亟待解决的问题。

孙红哲教授研究团队首次发现一种用于治疗胃溃疡的药物——枸橼酸铋，可以通过独特的金属置换机制使细菌内的NDM-1中的关键锌离子被铋离子所取代从而失去活性，进而使产NDM-1的超级细菌恢复对常见β内酰胺类抗生素的敏感性。相关研究指出，在抗生素疗法中加入枸橼酸铋作为NDM-1的抑制剂能够大幅提高抗生素的抗菌活性，并延缓细菌耐药性的进一步发展，这也极大程度地延长了了现有抗生素的使用寿命。孙教授首次提出无机小分子可作为一种新型的耐药因子抑制剂抗生素，拓展了无机药物在临床治疗领域的外延，相关工作于2018年发表在《自然•通讯》杂志上（Nat. Commun., 2018, 9, 439），得到社会的广泛关注和媒体报导。

图1. 铋结合NDM-1的晶体结构（左）及铋基抗生素疗法在体外（右上）及动物模型（右下）中的抗产NDM-1耐药菌的效果。图片来源：Nat. Commun., 2018, 9, 439。

除了NDM-1及相关的β内酰胺酶，针对不同临床相关的耐药因子的特点和功能，孙教授课题组通过结构分析和前期筛选，研发出了一系列的具有不同生物活性的金属基小分子。2020年，该团队在研究中发现了一种更具活性且更广谱的金属基耐药因子抑制剂——抗风湿类药物金诺芬。研究发现，这种金属药物不但能够高效地亲和NDM-1中的半胱氨酸，广谱地使β内酰胺酶失去活性，更能够通过对组胺酸/磷酸化的色胺酸的亲和作用破坏另一种能够使“最后防线”抗生素粘杆菌素失效的耐药因子——MCR-1的生物活性，从而成为两种具有截然不同结构的耐药因子的双重抑制剂。这部分工作也发表在《自然•通讯》杂志上（Nat. Commun., 2020, 11, 5263），对无机药物在多重耐药细菌感染治疗中的应用提供了一定的理论基础。

图2. 金结合NDM-1（左）、金结合MCR-1（中）的晶体结构及金诺芬与粘杆菌素在动物模型中的抗产NDM-5和MCR-1多重耐药菌活性（右）。图片来源：Nat. Commun., 2020, 11, 5263。

二、抗病毒金属药物的研发

新型冠状病毒是一种新兴的冠状病毒，自2019年12月迄今，已在全球造成超过6000 万确诊病例，其中更有逾140万的死亡病例。有鉴于对新型冠状病毒的完全有效的疫苗尚未上市，开发特异性抗病毒药物可能是预防或治疗新型冠状病毒引起感染的一种有效途径，而重新对目前可用的药物进行快速甄别和筛选是寻找对抗新型冠状病毒感染药物最为直接且实际的策略。有研究显示，瑞德西韦这种原先针对伊波拉病毒的广谱抗病毒药物，对治疗新型冠状病毒感染也有疗效，是治疗新冠感染的有力候选药物。然而，瑞德西韦的供应全球性短缺，价格相对高昂，以及对新型冠状病毒重症患者缺乏显著的临床效力等几个关键因素，严重限制了它的进一步临床应用。其他一系列正在进行测试的抗病毒药物的临床效力也有待验证。因此，迫切需要更广泛地评估临床获批药物，以寻找治疗新型冠状病毒感染的替代性策略。

金属化合物早已被发现可用作抗菌剂，但鲜见与其抗病毒性质相关的研究。孙红哲教授领导的研究团队主要针对新冠病毒其中一个主要蛋白质——病毒解旋酶；这种酶中含有起著关键作用的锌离子，而金属药物透过独特的金属置换机制，能不可逆地剥夺这些锌离子从而病毒解旋酶失去活性，从而抑制新冠病毒的繁衍复制。团队对一系列金属药物和相关化合物进行筛选后，发现一种临床常用含有金属铋的抗溃疡药物——枸橼酸铋雷尼替丁（RBC），在细胞水平和动物模型中，能显著降低新冠病毒的载量（病毒数目），具备潜力临床应用作爲有效的抗新型冠状病毒药物。RBC能显著降低受新型冠状病毒感染的动物细胞中的病毒量超过1,000倍以上，并表现出极低细胞毒性，细胞侧面的选择指数高达975。RBC在金色叙利亚仓鼠的感染模型中，证实能有效抑制新型冠状病毒的複製，减少上呼吸道和下呼吸道的病毒载量，同时也能缓解与病毒相关的肺炎等炎症。更为重要的是，与接受瑞德西韦治疗的实验组或赋形剂对照组（为实验作比较而设的组别）相比，接受RBC治疗受感染动物的新型冠状病毒载量明显降低近100倍，且主要炎症因子和趋一化因子的释放也得到显著的抑制。

图3. RBC展现出良好的抗新冠病毒活性。（a）RBC对新冠解旋酶的抑制作用；（b）RBC中的铋能有效置换出锌结合病毒解旋酶中的锌离子（c）RBC能在细胞水平上保护受新冠病毒感染的Vero E6细胞（d-f）RBC能在仓鼠的病毒感染模型中显著降低新冠病毒的（d）複製量和（e）滴度。（f）部分具有代表性的炎症因子和趋化因子的抑制在接受RBC治疗后得到显著抑制（g-j）新冠病毒N蛋白在（g）假手术组、（h）赋形剂组（i）瑞德西韦组和（j）RBC组的的相对含量。图片来源：Nat. Microbiol., 2020, 5, 1439-1448。

团队通过机理研究发现，新冠病毒中的解旋酶为RBC及其相关的含铋化合物的主要作用靶标。RBC通过独特的金属置换机制不可逆地剥夺新冠解旋酶中的起关键作用的锌离子，并进而形成铋结合解旋酶，从而使其失去生物活性。RBC及其相关的含铋化合物对新冠病毒解旋酶ATPase (IC₅₀ = 0.69 µM)和DNA解旋 (IC₅₀ = 0.70 µM) 活性均表现出明显的抑制作用。这一部分的工作发表在《自然•微生物》（Nat. Microbiol., 2020, 5, 1439-1448）上，他们的发现揭示了病毒解旋酶可作为药物治疗的潜在靶标以及含铋药物或其他相关金属药物用于临床治疗新型冠状病毒感染的巨大潜力。

三、整合多组学技术揭示金属药物作用机制

随着金属药物的广泛兴起，深入了解金属药物作用机制将有利于更好地了解疾病发病机理，从而有效促进药物研发。大多数金属药物具有多个靶点，能通过多种作用机制实现药物功能。近年来兴起的各种组学技术旨在系统全面分析药物分子的分布、形态结构、作用靶点、功能及生物分子机制，有效地推动了金属药物的发展。

孙红哲教授领导的研究团队近年来通过整合多种组学技术，实现了对金属药物分子机制的深入研究（Acc. Chem. Res., 2019, 52, 216-227; Curr. Opin. Chem. Biol., 2020, 55, 171-179）。通过IMAC/2D-GE、ICP-MS、LA-ICP-MS、MALDI-TOF-MS等联用技术，该团队系统分析了金属铋药物在幽门螺杆菌内的结合蛋白，揭示了金属铋在生物体内的分子靶点及其作用机制（Chem. Sci., 2018, 9, 7488–7497；Chem. Sci., 2017, 8, 4626-4633, Chem. Commun., 2015, 51, 16479–16482；Angew. Chem. Int. Ed., 2013, 52, 4916–4920）。同时，通过整合金属蛋白质组学，代谢组学及转录组学技术，发现金属镓药物的抗菌机制（Chem. Sci., 2019, 10, 6099-6106）。

作为一种广泛使用的抗菌药，银的抗菌性及其作用机制被广泛报道，然而，其相关的生物分子作用靶点仍有待于进一步研究。在前期多组学的工作基础上，该团队进一步建立了LC-GE-ICP-MS联用技术，并利用该联用技术成功分离检测了34种大肠杆菌中的银结合蛋白。通过生物信息学分析发现这些银结合蛋白主要参与到三羧酸（TCA）循环、乙醛酸循环、糖酵解、翻译、氧化应激反应和胞内pH调节等生物过程。进一步的多组学分析（金属蛋白组学、代谢组学、生物信息学、系统生物学）首次揭示了银的抗菌机制，研究发现银主要作用于糖酵解和TCA循环中的多种酶，进而影响乙醛酸循环通路，抑制细胞氧化应激反应，最终导致细菌损伤和死亡。该工作于2019年发表于PLoS Biol. 杂志上（PLoS Biol., 2019, 17, e3000292），为银的抗菌机制提供新的理论基础。同时，该团队通过进一步的结构分析发现银离子通过与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）中Cys149活性位点结合影响其其生物活性，从而影响糖酵解通路。进一步从分子生物学层面阐释了银的抗菌机制（Chem. Sci., 2019, 10, 7193-7199; Chem. Sci., 2020, 11, 11714-11719）。

图4. 多组学整合技术揭示银的抗菌机制。（a）LC-GE-ICP-MS流程图;（b）大肠杆菌中银结合蛋白;（c）银在各个生物通路中的分布；（d）银作用后大肠杆菌中代谢组的变化；（e）代谢产物增强银的抗菌能力；（f）银通过作用于多个通路实现抗菌效果。图片来源：PLoS Biol., 2019, 17, e3000292。

四、研发新型萤光探针监测细胞内蛋白质动态

通过化学或者生化工具标记蛋白质有利于理解蛋白质在活细胞中的功能、分布状况、动力学特征等。通过小分子萤光技术标记蛋白质技术不会对蛋白质本身的功能产生明显干扰，其中，利用金属螯合作用对蛋白质进行标记的方法由于简便性和高度特异性而备受瞩目。

孙教授的研究团队积极探索并合成了多种小分子金属基萤光探针，包括可以与蛋白质中四个半胱氨酸结构相结合的含砷FlAsH小分子及其衍生物、可以与六个组氨酸结构相结合的Ni-NTA小分子类等，大大减小了对目标蛋白的空间、功能干扰，攻克了传统金属萤光探针细胞膜穿透性差的问题。这些探针不仅可以快速标记细菌和哺乳细胞中的靶标蛋白，在複杂的植物组织中也可以发挥作用，故而可以广泛地监测目标蛋白质在不同机体中的分布和含量变化，有利于细胞原位蛋白质功能、药物靶标和抗性机制的研究，可以促进新药的研发进展（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2015, 112, 2948-2953）。这些研究成果被同年的《自然•生物技术》杂志（Nat. Biotech., 2015, 33, 359-359）选为亮点工作。此外该 研究也被多篇媒体广泛报导（Asian Scientist Magazine，Asia Research News）。该探针也可调成不同金属基，从而可以编辑金属蛋白质组。单细胞技术等系统生物学方法，用该探针首次揭示了含铋类药物对病原体的选择性毒性的原因（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2015, 112, 3211-3216）。

图5. Ni-NTA-AC萤光探针可以标记细胞内特定蛋白质（上），该探针可以快速进入细胞，在短时间内标记蛋白质（左下），探针萤光信号可以在2分钟时即可达到最高值并稳定保持（右下）。图片来源：Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2015, 112, 2948-2953。

五、利用深度学习进行机理研究

金属例如锌、铁、铜等在所有生命体正常生理活动中发挥了重要作用，近乎一半的金属酶需要利用金属离子调节生物转化过程。在蛋白质的金属结合位点上，金属离子会与特定氨基酸在第一配位球面形成配位键或者在第二配位球面形成非共价键。金属离子与氨基酸之间的非共价键对于蛋白质生理活性的正常发挥有重要作用，该位点的突变往往会导致金属蛋白脢活性或选择性的减弱甚至完全丧失，从而引发机体病变。理解在金属结合位点上与疾病相关的突变将促进对金属与蛋白质相互作用的分子机制，从而加快金属药物的研发。

孙教授的研究团队利用机器深度学习模式，首次对人类基因组与金属蛋白上金属结合位点有关的有害基因突变进行了成功预测，相关成果被发表在《自然•机器智能》上（Nat. Mach. Intell., 2019, 1, 561-567），为研发药物、治疗疾病提供了一种崭新的思路。该研究团队收集、总结金属结合位点的空间和氨基酸序列特征，然后用将该数据库输入到多通道神经网络演化模型中，通过模型的不断调适与训练，该组预测与疾病相关的突变将会发生在锌结合位点的第一和第二个配位球面上，球面曲度为0.90。通过这种深度学习方法来预测与疾病相关的金属蛋白突变位点的准确率可以高达82%。

与另一种常见模型PolyPhen-2相比，该深度学习模型的参数精准度和准确性更高，能够发现两种与新型疾病相关的金属位点突变，而PolyPhen-2模型却对此无能为力。这一研究成果在随后的《自然•机器智能》杂志上受到了高度重视（Nat. Mach. Intell., 2019, 1, 553-554），引发了学者的广泛兴趣。

图6. 深度学习模型训练中数据收集和特徵总结的工作流程。通过整合不同数据库得到与疾病相关金属结合位点突变数据，总结相关的空间和氨基酸序列特性，然后将之用以模型训练。图片来源Nat. Mach. Intell., 2019, 1, 562。

以上为孙红哲教授课题组近年来具有代表性的工作成果，其它更多具体详细的信息请参考该课题组的网站或发送邮件至hsun@hku.hk进一步讨论。此外，该课题组欢迎有志于科研，并对其研究方向感兴趣的同学联系报考博士以及申请博士后岗位。

孙红哲课题组成员。图片来源：香港大学

孙红哲

https://www.x-mol.com/university/faculty/49626

课题组网站

https://chemistry.hku.hk/staff/hzsun/labPage/index.html