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天然产物的独舞,还是人工产物的芭蕾?

一直以来,天然产物(natural products)因大自然赐予的独特结构骨架在药物开发领域始终占据着重要地位。不过,它的“影子”——人工产物(artifacts)就没那么受欢迎了,甚至被人们有意或无意的忽略。这些人工产物,往往是在分离纯化过程中,因pH值、温度、光照、氧气、湿度和金属离子等因素的影响,天然产物自身结构发生变化而产生的。可想而知,这类化合物分离纯化难,结构解不透,机理摸不清,似有似无,时有时无,说变就变,还摆不脱扔不掉,如影随行,堪称天然药化研究者的大麻烦。


小伙伴们在发表文章时都要设法绕过人工产物的“坑”:要么忽略它们的存在,要么标注在不显眼的“脚注”中(foot notes)。当然,总有不走运的小伙伴会掉坑里,把人工产物误打误撞鉴定成天然产物并发表出去。

然而,这些“坑”,其实也可以是能挖出“矿”的宝藏。澳大利亚昆士兰大学Robert J. Capon教授课题组在研究天然产物的同时,也致力甄别人工产物,解析其化学结构、分析其形成机理、开发其药用潜力,并获得一系列丰硕的成果。最近,他们就解开了一个尘封44年的谜题——微生物来源的稀有聚酮enterocin到底是天然产物还是人工产物?Robert J. Capon教授幽默地评价,enterocin并不是“孤独的舞者”,它和它的人工产物们更像是联袂演出的“芭蕾舞团”(Ballet of Isomers,图1)。

图1. enterocin及其转化形成的相关化合物。图片来源:Org. Lett.


Enterocin (化合物1) 最早于1976年被报道从日本的土壤链霉菌中分离纯化出来,其结构于同年通过X射线晶体衍射确定。Enterocin当时被报道具有抑制革兰氏阴性菌的生物活性。然而,同样是在1976年,化合物1又被报道分离自另一株链霉菌,且几乎没有抗菌活性。这些早期相互矛盾的研究结论引起了Robert J. Capon教授的怀疑。他敏锐地推测enterocin可能易于转化为人工产物。从1976年算起,44年的时间过去了,enterocins家族已经发展到5个化合物——5-deoxyenterocin (2)、enterocin-5-behenate (3)、 enterocin-5-arachidate (4)、3-epi-5- deoxyenterocin (5)(图2),对这些化合物的研究涵盖生物合成、异源表达和仿生生物合成以及生物活性等诸多方面。唯独没有人去研究enterocin (化合物1) 在温和储存条件下是否容易发生变化,它是否一直以原型存在?这一问题却是Robert J. Capon教授最感兴趣的。

图2. 已知的enterocins化合物1-5的结构。图片来源:Org. Lett.


Robert J. Capon教授的机会随着他们发现一株澳大利亚土壤链霉菌也能分离出enterocin (1)而来临。他们将分离到的enterocin (1)在氮气保护下室温放置,1没有发生变化。但是当温度缓慢升高到40 ℃时,1部分转变成两个新的异构体化合物67(图3)。将化合物1的乙腈溶液置于37 ℃,同样会导致化合物1部分转化,如果温度提高到60 ℃转化效应进一步放大。这表明转化效应是热诱导的。在乙腈溶液中加入三氟乙酸则会抑制这种转化。在真空40 ℃条件下,1部分转化为67(转化率约为30%)。他们在40 ℃氮气保护下分离单体67。经分析,67一经纯化为单体后,就会迅速互相转化,最终为平衡(6/7 = 4:3)混合物。幸运的是,6/7混合物的核磁数据非常清晰,可以通过一维和二维核磁共振技术完成其平面和立体结构解析。


有趣的是,当6/7平衡混合物在室温下被置于乙腈/水混合溶液时,会转化为新化合物8。化合物87的色谱保留时间,紫外吸收光谱和分子式都相同,但核磁数据不同。这显示两者结构相似性极高。经过详细的一维和二维核磁数据解析,他们推测,化合物7通过一个伪-椅-船反转变换(pseudo-chair−boat inversion transform)形成热力学稳定性更好的enterocin D (8)。他们发现,单体67在室温溶解于乙腈/水/0.01% 三氟乙酸混合溶液下,6小时后形成6/7平衡混合物,24小时后形成8(图3)。因此,化合物8在酸性乙腈/水混溶液中能够长期稳定存在。

图3. 核磁解析出的化合物6-8结构。图片来源:Org. Lett.


知道了化合物8在酸性条件下能稳定存在,那么碱性条件下情况又是怎样的呢?他们将化合物8在室温下储存于pH为9的乙腈/水混溶液中,24小时后居然转化出一个新化合物:enterocin E (化合物9)。同样在室温pH为9的条件下,当他们将化合物1溶解于乙腈时,1快速且定量地转化为8。然而,当1溶解于乙腈/水混溶液时,预测从18直至9的变化并未出现,取而代之的是最终又变出一个新化合物:enterocin F(化合物 10)。在pH值为11时,得到化合物10的转化率更高。


根据上述研究结果,他们推测了这些化合物的形成机制:化合物1通过热催化的酮醇过渡产生中间体ii通过3位酮基化形成中间体ii,在中性条件下ii通过5位羟基缩醛化形成化合物66通过分子内可逆的反-内酯化形成化合物7,并通过可逆作用与7达到平衡。7 通过伪-椅-船反转变换形成化合物8。在碱性水环境中,8的内酯部分迅速水解形成过渡态羟基酸iii,并迅速脱水转化为氧鎓中间体iviv通过6位羟基缩醛化形成化合物91在碱性水环境中消除水形成中间体v,随后v的内酯环打开形成化合物10(图4)。

图4. Enterocin (1)转化为6-10的可能机制。图片来源:Org. Lett.


最后,他们检测了化合物16/7混合物和8的抗菌活性,没有化合物显示出明显抑菌活性。显然,44年前对化合物1的研究并没有深入考虑其化学稳定性,将所谓的抗菌活性归因于化合物1也存在问题。


PS:再回头去看图1,就像作者说的,这些化合物咋看上去还真有点像芭蕾舞剧中的“四小天鹅”,不过就是腿有点短……


原文(扫描或长按二维码,识别后直达原文页面,或点此查看原文):

Exploring Natural Product Artifacts: The Polyketide Enterocin Warms to a Ballet of Isomers

Angela A. Salim, Kaumadi Samarasekera, Zeinab G. Khalil, and Robert J. Capon*

Org. Lett., 2020, 22, 4828–4832, DOI: 10.1021/acs.orglett.0c01629


(本文由水村山郭供稿)


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