惠利健/彭鲁英合作组实现人体肝细胞扩增技术突破

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肝脏疾病全球影响超过10亿人（中国约有4亿肝病患者），严重威胁人类的生命健康【1】。目前对于终末期肝脏疾病和急性肝衰竭最有效的治疗手段是原位肝器官移植，但是由于供体肝源的短缺和昂贵的治疗费用，严重影响了相关患者的治疗。随着细胞治疗和干细胞技术的蓬勃发展，研究者逐渐尝试使用人原代肝细胞与类肝细胞（ESC或iPSC定向分化的类肝细胞和成纤维细胞转分化的类肝细胞等）替代肝器官移植治疗肝脏疾病【2】。

由于人原代肝细胞来源有限、价格昂贵，而其他来源的类肝细胞在体内整合和成熟能力与原代肝细胞仍然有较大差距，所以如何在体外有效扩增人原代肝细胞成为了解决肝细胞治疗肝脏疾病最为关键的难题。然而，体外培养人原代肝细胞极其困难，一直都是领域里想要突破的难题。体外培养下，短时间内肝细胞形态就会改变、肝细胞功能急剧降低甚至完全丢失，进而发生细胞完全衰老和死亡。几十年来，全世界的研究者们在这方面做了大量工作试图攻克这一难题，然而直到最近这个问题都没有被很好地解决。

肝脏是哺乳动物再生能力较强的器官之一，细胞可塑性在其中扮演着非常重要的作用。2015年，Tarlow等人发现小鼠肝脏在损伤的情况下，成熟的肝细胞能够被重编程进入增殖的肝前体细胞状态。这个过程伴随着肝基因沉默以及肝前体细胞基因的逐步表达，并存在一种处于肝细胞和肝前体细胞间的中间态细胞【3，4】。在慢性肝病患者的肝脏中同样也存在类似状态的表达肝前体基因的肝细胞【5】。因此，研究者们一直希望能够在体外利用肝细胞的这种可塑性获取大量有功能能扩增的人肝细胞，从而彻底解决人肝细胞来源短缺的问题。2017年，相继有实验室报道了利用去分化为肝前体细胞状态的方法建立了体外培养大鼠和小鼠肝细胞的培养系统，并且证实了增殖的啮齿类肝细胞具有很好的肝脏整合能力【6，7】。这些工作为人原代肝细胞体外扩增提供了理论基础和实现的可能性。

中科院生物化学与细胞生物学研究所惠利健研究组长期从事肝损伤再生以及肝细胞相关转分化研究，近年来的代表性研究成果包括：成功将非肝细胞直接转分化为功能肝细胞【8,9】（Nature, 2011; Cell Stem Cell, 2014）；构建了新型生物人工肝装置，并成功救治肝衰竭大动物【10】（Cell Research, 2016）；提出了细胞属性转变过程中关键的染色体重塑“检查点”理论（惠利健组揭示肝脏细胞命运决定的分子机制）【11】（Cell Research, 2017）；与第二军医大学附属长征医院谢渭芬课题组合作明确胆管细胞是肝细胞再生的重要细胞来源等【12】（Cell Stem Cell, 2018）。

11月8号，惠利健研究组与同济大学彭鲁英研究组合作在Cell Stem Cell上发表了题为In vitro expansion of primary human hepatocytes with efficient liver repopulation capacity的重要研究成果，该项研究实现了人肝细胞的体外扩增，并证明了增殖的肝细胞体内功能与人原代肝细胞接近。这将很大程度上解决人肝细胞临床治疗肝脏疾病最为关键的难题，为肝细胞治疗奠定了坚实的研究基础。

概括起来，该研究主要包括以下四项创新点：

第一，该研究组建立了一整套全新的人肝细胞体外培养系统，将之前不能培养人原代肝细胞实现了体外高达10000倍的扩增，并且检测了不同种族、性别、年龄的多个个体在该培养系统中都表现出比较相似的增殖能力，这将为肝细胞的临床治疗提供了充足的细胞来源；

第二，该系统培养出的增殖的人肝细胞（ProliHH，proliferating human hepatocytes ）并没有转变成肝前体细胞。这些细胞依然保留了部分肝功能基因的表达和维持了部分肝细胞功能，通过整个表达谱分析发现ProliHH位于人原代肝细胞和肝前体细胞之间，处于共同表达肝功能基因和肝前体基因的双表型的状态。相对于肝前体细胞，这种更为接近原代肝细胞的双表型状态可能会使ProliHH在体内外的功能应用表现的更像人原代肝细胞；

第三，研究者利用3D培养的方式建立一套新型的肝向诱导的系统，通过该肝向诱导系统，ProliHH能够在体外快速成熟，成熟后的ProliHH的肝基因与肝功能表现出近似原代肝细胞的水平，这无疑为体外研究药物代谢以及嗜肝性病毒感染等方向的研究者提供了一个非常稳定的人肝细胞研究系统；

第四，最为关键的发现是研究者们将ProliHH移植到免疫缺陷的Fah敲除小鼠肝脏，这些细胞表现出近似人原代肝细胞在体内整合再殖的能力。60%的体内整合比例高于之前其他来源人肝细胞在体内的整合比例，并且在体内整合扩增后的ProliHH 的肝功能会得到进一步成熟，能分泌高达毫克级的人白蛋白并显示出人特异的药物代谢能力。更为重要的是，移植的ProliHH在降低小鼠的肝损伤和提高小鼠的生存率等方面表现出与原代肝细胞非常相似的救治效果。

显然地，这项工作提供一种很好的方式去获得可增殖的有功能并且具有高效体内整合能力的人肝细胞，有效地解决了人肝实质细胞的来源问题。这将为体外肝脏疾病的模型构建和药物筛选提供一个很好的研究系统以及为肝脏病人的肝细胞移植治疗奠定了坚实的基础。

体外扩增人体肝细胞相关研究是热点研究领域，国内外有多个课题组试图解决相关关键问题。值得一提的是，近期国内的鄢和新/王红阳/何志颖合作团队在Cell Research发表文章，报道了体外人类原代肝细胞向肝前体样细胞的可逆转化和扩增（Cell Research丨鄢和新/王红阳合作团队实现原代肝细胞的逆转和扩增，开创肝病研治新细胞源）【13】。

据悉，博士研究生张坤、张鲁狄博士等为本文共同第一作者，惠利健教授、彭鲁英教授和张鲁狄博士为本文共同通讯作者。

1. Wang F, Fan J, Zhang Z, et al. The global burden of liver disease: The major impact of China.Hepatology, 2015, 60(6):2099-2108.

2. Khan Z, Strom S C. Hepatocyte Transplantation in Special Populations: Clinical Use in Children.Methods in Molecular Biology, 2017, 1506:3.

3. Tarlow B D, Pelz C, Naugler W E, et al. Bipotential adult liver progenitors are derived from chronically injured mature hepatocytes..Cell Stem Cell, 2014, 15(5):605-618.

4. Yanger K, Zong Y, Maggs L R, et al. Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.Genes Dev,2013, 27(7):719-724.

5. Yoon S M, Gerasimidou D, Kuwahara R, et al. Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans.Hepatology,2011, 53, 964-973.

6. Katsuda T, Kawamata M, Hagiwara K, et al. Conversion of Terminally Committed Hepatocytes to Culturable Bipotent Progenitor Cells with Regenerative Capacity.Cell Stem Cell,2016, 20(1):41.

7. Wu H, Zhou X, Fu G B, et al. Reversible transition between hepatocytes and liver progenitors for in vitro hepatocyte expansion[J].Cell Research, 2017, 27(5).

8. Huang P, He Z, Ji S, Sun H, Xiang D, Liu C, Hu Y, Wang X, Hui L. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors.Nature. 2011 May 11; 475(7356):386-9.

9. Huang P, Zhang L, Gao Y, He Z, Yao D, Wu Z, Cen J, Chen X, Liu C, Hu Y, Lai D, Hu Z, Chen L, Zhang Y, Cheng X, Ma X, Pan G, Wang X, Hui L. Direct reprogramming of human fibroblasts to functional and expandable hepatocytes.Cell Stem Cell.2014 Mar 6; 14(3):370-84.

10. Mu W, Hu C, Zhang H, Qu Z, Cen J, Qiu Z, Li C, Ren H, Li Y, He X, Shi X, Hui L. miR-27b synergizes with anticancer drugs via p53 activation and CYP1B1 suppression.Cell Res. 2015 Apr; 25(4):477-95.

11. Ji S, Zhu L, Gao Y, Zhang X, Yan Y, Cen J, Li R, Zeng R, Liao L, Hou C, Gao Y, Gao S, Wei G, Hui L. Baf60b-mediated ATM-p53 activation blocks cell identity conversion by sensing chromatin opening.Cell Res. 2017, May; 27(5):642-656.

12. Deng, X., Zhang, X., Li, W., Feng, R. X., Li, L., Yi, G. R., ... & Xie, W. (2018). Chronic Liver Injury Induces Conversion of Biliary Epithelial Cells into Hepatocytes.Cell Stem Cell.Jul 5；23（1）：114-122

13. Fu G B, Huang WJ，Zeng M et al. Expansion and differentiation of human hepatocyte-derived liver progenitor-like cells and their use for the study of hepatotropic pathogens. Cell Research, 2018.10.