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Naturally split intein Npu DnaE mediated rapid generation of bispecific IgG antibodies
Methods ( IF 4.2 ) Pub Date : 2019-02-01 , DOI: 10.1016/j.ymeth.2018.10.001
Lei Han , Huifang Zong , Yuexian Zhou , Zhidi Pan , Jie Chen , Kai Ding , Yueqing Xie , Hua Jiang , Baohong Zhang , Huili Lu , John Gilly , Jianwei Zhu

High product purity, preserving natural IgG architecture, and excellent production efficiency are highly desirable in bispecific antibody manufacturing. We have reported a platform called Bispecific Antibody by Protein Trans-Splicing (BAPTS) to synthesize BsAbs with natural human IgG structure and no chain mispairing. In the method, two antibody fragments carrying different target-specificities are separately expressed in mammalian cells and subsequently fused to form BsAbs by utilizing the trans-splicing property of the split intein Npu DnaE. The hinge region of antibody, a region with less functional impact, is selected for conjugating the two fragments. The method involves the following steps: (i) constructing five plasmids coding antibody components; (ii) separately expressing and purifying two antibody fragments A and B. Fragment A contains one Fab, "Knobs-into-Holes" mutations in the CH3 domain and NPU DnaEC. Fragment B contains another Fab and NPU DnaEN; (iii) mixing of fragments A and B under permissive reducing conditions in vitro to enable trans-splicing reaction; (iv) removing the reductant to allow re-oxidation of disulfide bonds; (v) isolating BsAb product from unreacted precursors by affinity chromatography. The method allows correct assembly of two heavy and two light chains to form bispecific IgG antibodies in natural structure with no synthetic linkers. No chain mispairing was observed in the product by UPLC-MASS. In addition, the observed kinetics and low reaction activation energy confirmed that the trans-splicing is thermodynamically favored reaction. The BAPTS technology is feasible for industrial applications.

中文翻译:

自然分裂内含肽 Npu DnaE 介导的双特异性 IgG 抗体的快速生成

高产品纯度、保留天然 IgG 结构和出色的生产效率是双特异性抗体制造中非常需要的。我们已经报道了一种称为双特异性抗体通过蛋白质反式剪接 (BAPTS) 的平台,用于合成具有天然人 IgG 结构且无链错配的 BsAb。在该方法中,携带不同靶点特异性的两个抗体片段分别在哺乳动物细胞中表达,随后利用分裂内含肽 Npu DnaE 的反式剪接特性融合形成 BsAb。抗体的铰链区,一个功能影响较小的区域,被选择用于缀合两个片段。该方法包括以下步骤:(i)构建五个编码抗体组分的质粒;(ii) 分别表达和纯化两个抗体片段 A 和 B。片段 A 包含一个 Fab,CH3 结构域和 NPU DnaEC 中的“Knobs-into-Holes”突变。片段 B 包含另一个 Fab 和 NPU DnaEN;(iii) 在体外允许的还原条件下混合片段 A 和 B 以进行反式剪接反应;(iv) 去除还原剂以允许二硫键重新氧化;(v) 通过亲和层析从未反应的前体中分离 BsAb 产物。该方法允许正确组装两条重链和两条轻链,以形成天然结构的双特异性 IgG 抗体,无需合成接头。UPLC-MASS 在产物中未观察到链错配。此外,观察到的动力学和低反应活化能证实了反式剪接是热力学有利的反应。BAPTS 技术对于工业应用是可行的。片段 B 包含另一个 Fab 和 NPU DnaEN;(iii) 在体外允许的还原条件下混合片段 A 和 B 以进行反式剪接反应;(iv) 去除还原剂以允许二硫键重新氧化;(v) 通过亲和层析从未反应的前体中分离 BsAb 产物。该方法允许正确组装两条重链和两条轻链,以形成天然结构的双特异性 IgG 抗体,无需合成接头。UPLC-MASS 在产物中未观察到链错配。此外,观察到的动力学和低反应活化能证实了反式剪接是热力学有利的反应。BAPTS 技术对于工业应用是可行的。片段 B 包含另一个 Fab 和 NPU DnaEN;(iii) 在体外允许的还原条件下混合片段 A 和 B 以进行反式剪接反应;(iv) 去除还原剂以允许二硫键重新氧化;(v) 通过亲和层析从未反应的前体中分离 BsAb 产物。该方法允许正确组装两条重链和两条轻链,以形成天然结构的双特异性 IgG 抗体,无需合成接头。UPLC-MASS 在产物中未观察到链错配。此外,观察到的动力学和低反应活化能证实了反式剪接是热力学有利的反应。BAPTS 技术对于工业应用是可行的。(iii) 在体外允许的还原条件下混合片段 A 和 B 以进行反式剪接反应;(iv) 去除还原剂以允许二硫键重新氧化;(v) 通过亲和层析从未反应的前体中分离 BsAb 产物。该方法允许正确组装两条重链和两条轻链,以形成天然结构的双特异性 IgG 抗体,无需合成接头。UPLC-MASS 在产物中未观察到链错配。此外,观察到的动力学和低反应活化能证实了反式剪接是热力学有利的反应。BAPTS 技术对于工业应用是可行的。(iii) 在体外允许的还原条件下混合片段 A 和 B 以进行反式剪接反应;(iv) 去除还原剂以允许二硫键重新氧化;(v) 通过亲和层析从未反应的前体中分离 BsAb 产物。该方法允许正确组装两条重链和两条轻链,以形成天然结构的双特异性 IgG 抗体,无需合成接头。UPLC-MASS 在产物中未观察到链错配。此外,观察到的动力学和低反应活化能证实了反式剪接是热力学有利的反应。BAPTS 技术对于工业应用是可行的。该方法允许正确组装两条重链和两条轻链,以形成天然结构的双特异性 IgG 抗体,无需合成接头。UPLC-MASS 在产物中未观察到链错配。此外,观察到的动力学和低反应活化能证实了反式剪接是热力学有利的反应。BAPTS 技术对于工业应用是可行的。该方法允许正确组装两条重链和两条轻链,以形成天然结构的双特异性 IgG 抗体,无需合成接头。UPLC-MASS 在产物中未观察到链错配。此外,观察到的动力学和低反应活化能证实了反式剪接是热力学有利的反应。BAPTS 技术对于工业应用是可行的。
更新日期:2019-02-01
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