Abstract In the United States, Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) O157 and six non-O157 serogroups O26, O45, O103, O111, O121 and O145 are considered adulterants in non-intact beef. Further, Salmonella is responsible for one of the highest numbers of foodborne infections worldwide. Multiple foods, especially meats, are routinely tested for these pathogens using methods like PCR. However, with such a large group of organisms, multiplexing using probe-based PCR assays is expensive due to the need for differently labeled oligonucleotide probes and sophisticated instrumentation. The aim of this study was to design low-cost multiplex real-time PCR assays for the detection of seven STEC serogroups, stx1, stx2 genes and virulent Salmonella. Two multiplex real-time PCR melt curve assays with internal amplification controls (IAC) were standardized. The first assay detected E. coli O121, E. coli O145, E. coli O157, stx1, and stx2. The second assay targeted E. coli O26, E. coli O111, E. coli O103, E. coli O45, and Salmonella. Ground beef and beef trim inoculated with 5–27 CFU/325 g of STEC and 9–36 CFU/325 g of Salmonella could be detected following an 8–10 h enrichment at 40 °C ± 2 °C in buffered peptone water containing 8 mg/L vancomycin. The assays showed reproducible results for beef products with different fat contents. These assays do not rely on fluorescent-labeled probes or immunomagnetic beads, yet accurately detect seven STEC serogroups, seven stx gene subtypes and Salmonella, making them suitable for routine testing of STEC and Salmonella in beef.

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两种高分辨率熔解曲线多重实时PCR检测产志贺毒素大肠杆菌、stx1、stx2和沙门氏菌

摘要 在美国，产志贺毒素大肠杆菌 (STEC) O157 和六个非 O157 血清群 O26、O45、O103、O111、O121 和 O145 被认为是非完整牛肉中的掺杂物。此外，沙门氏菌是全球食源性感染数量最多的原因之一。使用 PCR 等方法对多种食物（尤其是肉类）进行常规检测这些病原体。然而，对于如此庞大的生物群，由于需要不同标记的寡核苷酸探针和复杂的仪器，使用基于探针的 PCR 检测进行多重检测是昂贵的。本研究的目的是设计低成本的多重实时 PCR 检测方法，用于检测七种 STEC 血清群、stx1、stx2 基因和毒性沙门氏菌。两个带有内部扩增对照 (IAC) 的多重实时 PCR 熔解曲线测定被标准化。第一次检测检测到大肠杆菌 O121、大肠杆菌 O145、大肠杆菌 O157、stx1 和 stx2。第二个检测针对大肠杆菌 O26、大肠杆菌 O111、大肠杆菌 O103、大肠杆菌 O45 和沙门氏菌。在 40 °C ± 2 °C 的缓冲蛋白胨水中浓缩 8-10 小时后，可以检测到用 5-27 CFU/325 g STEC 和 9-36 CFU/325 g 沙门氏菌接种的碎牛肉和牛肉碎。毫克/升万古霉素。分析表明，对于不同脂肪含量的牛肉产品，结果具有可重复性。这些检测不依赖荧光标记探针或免疫磁珠，但可准确检测七个 STEC 血清群、七个 stx 基因亚型和沙门氏菌，使其适用于牛肉中 STEC 和沙门氏菌的常规检测。大肠杆菌 O121、大肠杆菌 O145、大肠杆菌 O157、stx1 和 stx2。第二个检测针对大肠杆菌 O26、大肠杆菌 O111、大肠杆菌 O103、大肠杆菌 O45 和沙门氏菌。在 40 °C ± 2 °C 的缓冲蛋白胨水中浓缩 8-10 小时后，可以检测到用 5-27 CFU/325 g STEC 和 9-36 CFU/325 g 沙门氏菌接种的碎牛肉和牛肉碎。毫克/升万古霉素。分析表明，对于不同脂肪含量的牛肉产品，结果具有可重复性。这些检测不依赖荧光标记探针或免疫磁珠，但可准确检测七个 STEC 血清群、七个 stx 基因亚型和沙门氏菌，使其适用于牛肉中 STEC 和沙门氏菌的常规检测。大肠杆菌 O121、大肠杆菌 O145、大肠杆菌 O157、stx1 和 stx2。第二个检测针对大肠杆菌 O26、大肠杆菌 O111、大肠杆菌 O103、大肠杆菌 O45 和沙门氏菌。在 40 °C ± 2 °C 的缓冲蛋白胨水中浓缩 8-10 小时后，可以检测到用 5-27 CFU/325 g STEC 和 9-36 CFU/325 g 沙门氏菌接种的碎牛肉和牛肉碎。毫克/升万古霉素。分析表明，对于不同脂肪含量的牛肉产品，结果具有可重复性。这些检测不依赖荧光标记探针或免疫磁珠，但可准确检测七个 STEC 血清群、七个 stx 基因亚型和沙门氏菌，使其适用于牛肉中 STEC 和沙门氏菌的常规检测。在 40 °C ± 2 °C 的缓冲蛋白胨水中浓缩 8-10 小时后，可以检测到用 5-27 CFU/325 g STEC 和 9-36 CFU/325 g 沙门氏菌接种的碎牛肉和牛肉碎。毫克/升万古霉素。分析表明，对于不同脂肪含量的牛肉产品，结果具有可重复性。这些检测不依赖荧光标记探针或免疫磁珠，但可准确检测七个 STEC 血清群、七个 stx 基因亚型和沙门氏菌，使其适用于牛肉中 STEC 和沙门氏菌的常规检测。在 40 °C ± 2 °C 的缓冲蛋白胨水中浓缩 8-10 小时后，可以检测到用 5-27 CFU/325 g STEC 和 9-36 CFU/325 g 沙门氏菌接种的碎牛肉和牛肉碎。毫克/升万古霉素。分析表明，对于不同脂肪含量的牛肉产品，结果具有可重复性。这些检测不依赖荧光标记探针或免疫磁珠，但可准确检测七个 STEC 血清群、七个 stx 基因亚型和沙门氏菌，使其适用于牛肉中 STEC 和沙门氏菌的常规检测。