The MS2 system has been widely used, in organisms ranging from bacteria to higher eukaryotes, to image single mRNAs in intact cells with high precision. We have recently re-engineered the MS2 system for accurate detection of mRNAs in living Saccharomyces cerevisiae. Previous MS2 systems affected the degradation of the tagged mRNA, which led to accumulation of MS2 fragments and to erroneous conclusions about mRNA localization and expression. Here we describe a step-by-step protocol for the use of our latest MS2 system (MBSV6) for detecting endogenously tagged mRNAs using wide-field fluorescent microscopy in living yeast. The procedure is divided into three stages: tagging of endogenous gene with MBSV6 (~2 weeks), a two-color single-molecule RNA fluorescent in situ hybridization (smFISH) procedure to quantitatively assess whether mRNAs tagged with MS2 and MS2-coat protein (MCP) behave like untagged mRNAs (2 d, plus additional time for quantification), and a procedure to quantify single mRNAs by live imaging using wide-field microscopy (1 d, plus additional time for quantification). With this method it is now possible to interrogate all phases of mRNA expression, from transcription through decay. The described protocol is designed for S. cerevisiae; however, we think that our approach and the considerations discussed here can be extended to Escherichia coli, Drosophila, Caenorhabditis elegans, and mammalian cells.

中文翻译：

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使用重新设计的MS2系统检测活啤酒酵母中的单mRNA。

MS2系统已广泛用于从细菌到高等真核生物的生物中，以高精度对完整细胞中的单个mRNA进行成像。我们最近对MS2系统进行了重新设计，以准确检测活酿酒酵母中的mRNA。以前的MS2系统影响标记的mRNA的降解，这导致MS2片段的积累以及有关mRNA定位和表达的错误结论。在这里，我们描述了使用最新的MS2系统（MBSV6）进行分步操作的协议，该系统用于在活酵母中使用广域荧光显微镜检测内源标记的mRNA。该过程分为三个阶段：用MBSV6标记内源基因（约2周），一种双色单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）程序，以定量评估用MS2和MS2外壳蛋白（MCP）标记的mRNA是否表现为未标记的mRNA（2 d，加上额外的定量时间），以及一种程序通过使用宽视野显微镜（1 d，加上额外的定量时间）进行实时成像来定量单个mRNA。通过这种方法，现在有可能询问从转录到衰变的mRNA表达的所有阶段。所描述的协议是为酿酒酵母而设计的。但是，我们认为我们的方法和此处讨论的注意事项可以扩展到大肠杆菌，果蝇，秀丽隐杆线虫和哺乳动物细胞。以及使用宽视野显微镜（1 d，加上额外的定量时间）通过实时成像对单个mRNA进行定量的程序。通过这种方法，现在有可能询问从转录到衰变的mRNA表达的所有阶段。所描述的协议是为酿酒酵母而设计的。但是，我们认为我们的方法和此处讨论的注意事项可以扩展到大肠杆菌，果蝇，秀丽隐杆线虫和哺乳动物细胞。以及使用宽视野显微镜（1 d，加上额外的定量时间）通过实时成像对单个mRNA进行定量的程序。通过这种方法，现在有可能询问从转录到衰变的mRNA表达的所有阶段。所描述的协议是为酿酒酵母而设计的。但是，我们认为我们的方法和此处讨论的注意事项可以扩展到大肠杆菌，果蝇，秀丽隐杆线虫和哺乳动物细胞。