5-Methyl-2'-deoxycytidine (5-mdC), 5-hydroxymethyl-2'-deoxycytidine (5-hmdC), 5-methylcytidine (5-mrC) and 5-hydroxymethylcytidine (5-hmrC) are epigenetic marks of DNA and RNA, and aberrant levels of these modified nucleosides were found to be associated with various cancers. Urine is a preferred source of biological fluid for biomarker discovery because the sample collection process is not invasive to patients. Herein, we developed a novel malic acid-enhanced hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS) method for sensitive and simultaneous quantification of the modified cytosine nucleosides in human urine. Malic acid markedly increased the detection sensitivities of all four cytosine nucleosides, with the limits of detection (LODs) for 5-mdC, 5-hmdC, 5-mrC and 5-hmrC being 0.025, 0.025, 0.025 and 0.050 fmol, respectively. By using this method, we demonstrated, for the first time, the presence of 5-hmrC in human urine, and we successfully quantified 5-mdC, 5-hmdC, 5-mrC and 5-hmrC in urine samples collected from 90 patients with colorectal cancer (CRC) and 90 healthy controls. We found that the levels of 5-mdC, 5-hmdC, 5-mrC and 5-hmrC in urine were all substantially decreased in CRC patients, suggesting that these modified nucleosides might have great potential to be noninvasive biomarkers for early detection and prognosis of CRC. Together, we established a novel and sensitive method for detecting 5-methylated and 5-hydroxymethylated cytosine nucleosides in human urine and the results from this study may stimulate future investigations about the regulatory roles of these cytosine derivatives in the initiation and development of CRC.

中文翻译：

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使用亲水相互作用液相色谱-串联质谱法分析人尿中 5-甲基-2'-脱氧胞苷、5-羟甲基-2'-脱氧胞苷、5-甲基胞苷和 5-羟甲基胞苷的新型苹果酸增强方法

5-甲基-2'-脱氧胞苷（5-mdC）、5-羟甲基-2'-脱氧胞苷（5-hmdC）、5-甲基胞苷（5-mrC）和5-羟甲基胞苷（5-hmrC）是DNA的表观遗传标记和 RNA 以及这些修饰核苷的异常水平被发现与各种癌症有关。尿液是生物标志物发现的首选生物液体来源，因为样本收集过程对患者无害。在此，我们开发了一种新的苹果酸增强型亲水相互作用液相色谱-串联质谱 (HILIC-MS/MS) 方法，用于对人尿中修饰的胞嘧啶核苷进行灵敏且同步的定量。苹果酸显着提高了所有四种胞嘧啶核苷的检测灵敏度，5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的检测限 (LOD) 分别为 0.025、0.025、0.025 和 0。分别为 050 fmol。通过使用这种方法，我们首次证明了人类尿液中 5-hmrC 的存在，并且我们成功地量化了从 90 名患有以下疾病的患者收集的尿液样本中的 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC。结直肠癌 (CRC) 和 90 名健康对照。我们发现结直肠癌患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，表明这些修饰的核苷可能有很大潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。分别。通过使用这种方法，我们首次证明了人类尿液中 5-hmrC 的存在，并且我们成功地量化了从 90 名患有以下疾病的患者收集的尿液样本中的 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC。结直肠癌 (CRC) 和 90 名健康对照。我们发现 CRC 患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，这表明这些修饰的核苷可能有很大的潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。分别。通过使用这种方法，我们首次证明了人类尿液中 5-hmrC 的存在，并且我们成功地量化了从 90 名患有以下疾病的患者收集的尿液样本中的 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC。结直肠癌 (CRC) 和 90 名健康对照。我们发现结直肠癌患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，表明这些修饰的核苷可能有很大潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。通过使用这种方法，我们首次证明了人类尿液中 5-hmrC 的存在，并且我们成功地量化了从 90 名患有以下疾病的患者收集的尿液样本中的 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC。结直肠癌 (CRC) 和 90 名健康对照。我们发现结直肠癌患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，表明这些修饰的核苷可能有很大潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。通过使用这种方法，我们首次证明了人类尿液中 5-hmrC 的存在，并且我们成功地量化了从 90 名患有以下疾病的患者收集的尿液样本中的 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC。结直肠癌 (CRC) 和 90 名健康对照。我们发现结直肠癌患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，表明这些修饰的核苷可能有很大潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会刺激未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。首次发现人类尿液中存在 5-hmrC，我们成功量化了从 90 名结直肠癌 (CRC) 患者和 90 名健康人收集的尿液样本中的 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC控件。我们发现结直肠癌患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，表明这些修饰的核苷可能有很大潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。首次发现人类尿液中存在 5-hmrC，我们成功量化了从 90 名结直肠癌 (CRC) 患者和 90 名健康人收集的尿液样本中的 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC控件。我们发现结直肠癌患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，表明这些修饰的核苷可能有很大潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。我们成功地量化了从 90 名结直肠癌 (CRC) 患者和 90 名健康对照收集的尿液样本中的 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC。我们发现结直肠癌患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，表明这些修饰的核苷可能有很大潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。我们成功地量化了从 90 名结直肠癌 (CRC) 患者和 90 名健康对照收集的尿液样本中的 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC。我们发现结直肠癌患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，表明这些修饰的核苷可能有很大潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。从 90 名结直肠癌 (CRC) 患者和 90 名健康对照者收集的尿液样本中的 5-mrC 和 5-hmrC。我们发现结直肠癌患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，表明这些修饰的核苷可能有很大潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。从 90 名结直肠癌 (CRC) 患者和 90 名健康对照者收集的尿液样本中的 5-mrC 和 5-hmrC。我们发现结直肠癌患者尿液中 5-mdC、5-hmdC、5-mrC 和 5-hmrC 的水平均显着降低，表明这些修饰的核苷可能有很大潜力成为早期检测和预后的无创生物标志物。 CRC。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。表明这些修饰的核苷可能具有作为CRC早期检测和预后的无创生物标志物的巨大潜力。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会激发未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。表明这些修饰的核苷可能具有作为CRC早期检测和预后的无创生物标志物的巨大潜力。我们共同建立了一种检测人尿中 5-甲基化和 5-羟甲基化胞嘧啶核苷的新颖且灵敏的方法，该研究的结果可能会刺激未来对这些胞嘧啶衍生物在 CRC 发生和发展中的调节作用的研究。