As a popular sample preparation approach, filter-aided sample preparation (FASP) has been widely used in proteomic analysis. However, several limitations have been noted, including sample loss during filtration, repetitive centrifugation steps, and the possibility of breakage of filtration membrane. Extraction bias among different sample preparation strategies presents another challenge. To overcome these limitations and address remaining challenges, we developed a novel surfactant and chaotropic agent assisted sequential extraction/on-pellet digestion (SCAD) protocol. The new strategy resulted in higher protein yield and improved peptide recovery and protein coverage compared to two conventional sample preparation methods (FASP and urea). In combination of three strategies, more than 10,000 distinct protein groups were identified with 1% FDR from MDA-MB-231 cells without any prefractionation. This in-depth proteome analysis was accomplished by optimization of protein extraction, enzymatic digestion, LC gradient, and peptide sequencing method. Ingenuity Pathways Analysis (IPA) of proteins exclusively identified in SCAD revealed several crucial signaling pathways that regulate breast cancer progression. SCAD also enabled an unbiased extraction of different categories of proteins (membrane, intracellular, nuclear) associated with tumorigenesis, which integrates the advantages of FASP and urea extraction. This novel strategy expedites comprehensive protein identification, which is applicable for biomarker discovery in various types of cancers.

中文翻译：

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表面活性剂和离液剂辅助的顺序提取/颗粒消化（SCAD），用于增强蛋白质组学。

作为一种流行的样品制备方法，过滤辅助样品制备（FASP）已被广泛用于蛋白质组学分析中。但是，已经注意到了一些限制，包括过滤过程中的样品损失，重复的离心步骤以及滤膜破裂的可能性。不同样品制备策略之间的提取偏差提出了另一个挑战。为了克服这些局限性并解决仍然存在的挑战，我们开发了一种新型的表面活性剂和离液剂辅助的顺序萃取/沉淀法（SCAD）方案。与两种传统的样品制备方法（FASP和尿素）相比，该新策略可提高蛋白质产量，并提高肽回收率和蛋白质覆盖率。结合三种策略（超过10种），从MDA-MB-231细胞中以1％FDR鉴定出000个不同的蛋白组，没有任何预分离。通过蛋白质提取，酶消化，LC梯度和肽段测序方法的优化，可以完成这种深入的蛋白质组分析。专门在SCAD中鉴定的蛋白质的独创性途径分析（IPA）显示了调节乳腺癌进展的几种关键信号通路。SCAD还能够无偏地提取与肿瘤发生相关的不同类别的蛋白质（膜，细胞内，核蛋白），这融合了FASP和尿素提取的优势。这种新颖的策略加速了全面的蛋白质鉴定，可用于发现各种类型癌症中的生物标志物。通过蛋白质提取，酶消化，LC梯度和肽段测序方法的优化，可以完成这种深入的蛋白质组分析。专门在SCAD中鉴定的蛋白质的独创性途径分析（IPA）显示了调节乳腺癌进展的几种关键信号通路。SCAD还能够无偏地提取与肿瘤发生相关的不同类别的蛋白质（膜，细胞内，核蛋白），这融合了FASP和尿素提取的优势。这种新颖的策略加速了全面的蛋白质鉴定，可用于发现各种类型癌症中的生物标志物。通过蛋白质提取，酶消化，LC梯度和肽段测序方法的优化，可以完成这种深入的蛋白质组分析。专门在SCAD中鉴定的蛋白质的独创性途径分析（IPA）显示了调节乳腺癌进展的几种关键信号通路。SCAD还能够无偏地提取与肿瘤发生相关的不同类别的蛋白质（膜，细胞内，核蛋白），这融合了FASP和尿素提取的优势。这种新颖的策略加速了全面的蛋白质鉴定，可用于发现各种类型癌症中的生物标志物。专门在SCAD中鉴定的蛋白质的独创性途径分析（IPA）显示了调节乳腺癌进展的几种关键信号通路。SCAD还能够无偏地提取与肿瘤发生相关的不同类别的蛋白质（膜，细胞内，核蛋白），这融合了FASP和尿素提取的优势。这种新颖的策略加速了全面的蛋白质鉴定，可用于发现各种类型癌症中的生物标志物。专门在SCAD中鉴定的蛋白质的独创性途径分析（IPA）显示了调节乳腺癌进展的几种关键信号通路。SCAD还能够无偏地提取与肿瘤发生相关的不同类别的蛋白质（膜，细胞内，核蛋白），这融合了FASP和尿素提取的优势。这种新颖的策略加速了全面的蛋白质鉴定，可用于发现各种类型癌症中的生物标志物。