Liquid biopsies using body fluids have gained much attention in recent years due to their multiple advantages in clinical diagnosis, such as less/non-invasive collection, suitability for longitudinal disease monitoring, and better representation of tumor heterogeneity. As an attractive choice for liquid biopsy, urine proteins and their post-translational modifications (PTMs) have the potential to offer significant insights into physiological variations and pathological changes in the human body. However, due to the intrinsically large variability of urine proteins and their PTMs among different individuals, there is a high demand for strategies for high-throughput analysis of a large number of samples to obtain a comprehensive view and a reliable reference interval of the urine proteome. In this work, we proposed a new urine phosphoproteome sample processing strategy that combines fast protein extraction, efficient multiple immobilized-proteases digestion, and tandemly connected centrifugal tips device-based facile phosphopeptide enrichment & fractionation. This strategy is capable of paralleled sample processing with an approximate five-fold reduction in processing time and is therefore particularly suitable for handling a large number of urine samples. Totally, we identified 4196 phosphosites in human urine proteins by mass spectrometry in replicated tests, a number which is dozens of times larger than those previously reported. Therefore, this strategy may have great potential in urine-based phosphoprotein biomarker screening and drug response studies.

近年来，使用体液进行的液体活检在临床诊断中具有多重优势，例如采集更少/无创，适合纵向疾病监测以及更好地代表肿瘤异质性，因此备受关注。作为液体活检的一种有吸引力的选择，尿蛋白及其翻译后修饰（PTM）有潜力为人体的生理变化和病理变化提供重要的见识。然而，由于不同个体之间尿蛋白及其PTM的内在差异很大，因此对大量样品进行高通量分析以获取尿蛋白的全面视图和可靠参考区间的策略存在很高的需求。在这项工作中，我们提出了一种新的尿液磷酸化蛋白质组样品处理策略，该策略结合了快速蛋白质提取，高效的多种固定化蛋白酶消化以及串联连接的基于离心尖端装置的简便磷酸肽富集和分级分离的策略。这种策略能够并行处理样品，处理时间减少了大约五倍，因此特别适合处理大量尿液样品。总共，我们在重复测试中通过质谱法鉴定了人类尿液蛋白质中的4196个磷酸位，这个数字比以前报道的要大几十倍。因此，该策略在基于尿的磷蛋白生物标志物筛选和药物反应研究中可能具有巨大潜力。高效的多种固定化蛋白酶消化，以及串联连接的基于离心尖端装置的简便磷酸肽富集和分级分离。这种策略能够并行处理样品，处理时间减少了大约五倍，因此特别适合处理大量尿液样品。总共，我们在重复测试中通过质谱法鉴定了人类尿液蛋白质中的4196个磷酸位，这个数字比以前报道的要大几十倍。因此，该策略在基于尿液的磷蛋白生物标志物筛选和药物反应研究中可能具有巨大潜力。高效的多种固定化蛋白酶消化，以及串联连接的基于离心尖端装置的简便磷酸肽富集和分级分离。这种策略能够并行处理样品，处理时间减少了大约五倍，因此特别适合处理大量尿液样品。总共，我们在重复测试中通过质谱法鉴定了人类尿液蛋白质中的4196个磷酸位，这个数字比以前报道的要大几十倍。因此，该策略在基于尿液的磷蛋白生物标志物筛选和药物反应研究中可能具有巨大潜力。这种策略能够并行处理样品，处理时间减少了大约五倍，因此特别适合处理大量尿液样品。总共，我们在重复测试中通过质谱法鉴定了人类尿液蛋白质中的4196个磷酸位，这个数字比以前报道的要大几十倍。因此，该策略在基于尿液的磷蛋白生物标志物筛选和药物反应研究中可能具有巨大潜力。这种策略能够并行处理样品，处理时间减少了大约五倍，因此特别适合处理大量尿液样品。总共，我们在重复测试中通过质谱法鉴定了人类尿液蛋白质中的4196个磷酸位，这个数字比以前报道的要大几十倍。因此，该策略在基于尿液的磷蛋白生物标志物筛选和药物反应研究中可能具有巨大潜力。