We describe epitope mapping data using multiple covalent labeling footprinting-mass spectrometry (MS) techniques coupled with negative stain transmission electron microscopy (TEM) data to analyze the antibody–antigen interactions in a sandwich enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA). Our hydroxyl radical footprinting-MS data using fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) indicates suppression of labeling across the antigen upon binding either of the monoclonal antibodies (mAbs) utilized in the ELISA. Combining these data with Western blot analysis enabled the identification of the putative epitopes that appeared to span regions containing N-linked glycans. An additional structural mapping technique, carboxyl group footprinting-mass spectrometry using glycine ethyl ester (GEE) labeling, was used to confirm the epitopes. Deglycosylation of the antigen resulted in loss of potency in the ELISA, supporting the FPOP and GEE labeling data by indicating N-linked glycans are necessary for antigen binding. Finally, mapping of the epitopes onto the antigen crystal structure revealed an approximate 90° relative spatial orientation, optimal for a noncompetitive binding ELISA. TEM data shows both linear and diamond antibody–antigen complexes with a similar binding orientation as predicted from the two footprinting-MS techniques. This study is the first of its kind to utilize multiple bottom-up footprinting-MS techniques and TEM visualization to characterize the monoclonal antibody-antigen binding interactions of critical reagents used in a quality control (QC) lot-release ELISA.

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我们使用多重共价标记足迹质谱法（MS）结合负染色透射电子显微镜（TEM）数据来描述表位作图数据，以在三明治酶联免疫吸附测定（ELISA）中分析抗体-抗原相互作用。我们使用蛋白质的快速光化学氧化（FPOP）进行的羟基自由基足迹分析MS数据表明，结合ELISA中使用的任何一种单克隆抗体（mAb）后，整个抗原上的标记都受到抑制。将这些数据与蛋白质印迹分析相结合，可以鉴定出似乎跨越包含N-连接聚糖的区域的假定表位。另一种结构作图技术，即使用甘氨酸乙酯（GEE）标记的羧基足迹质谱法，用于确定表位。抗原的去糖基化导致ELISA效能下降，通过表明N-连接的聚糖对于抗原结合是必需的，从而支持FPOP和GEE标记数据。最后，将抗原决定簇定位到抗原晶体结构上显示出大约90°的相对空间方向，这是非竞争性结合ELISA的最佳选择。TEM数据显示线性和菱形抗体-抗原复合物的结合方向与两种足迹MS技术所预测的相似。这项研究是首次利用多种自下而上的足迹MS技术和TEM可视化技术来表征用于质量控制（QC）批量释放ELISA的关键试剂的单克隆抗体-抗原结合相互作用。通过表明N-连接的聚糖对于抗原结合是必需的，从而支持FPOP和GEE标记数据。最后，将抗原决定簇定位到抗原晶体结构上显示出大约90°的相对空间方向，这是非竞争性结合ELISA的最佳选择。TEM数据显示线性和钻石抗体-抗原复合物的结合方向与两种足迹MS技术所预测的相似。这项研究是首次利用多种自下而上的足迹MS技术和TEM可视化技术来表征用于质量控制（QC）批量释放ELISA的关键试剂的单克隆抗体-抗原结合相互作用。通过表明N-连接的聚糖对于抗原结合是必需的，从而支持FPOP和GEE标记数据。最后，将抗原决定簇定位到抗原晶体结构上显示出大约90°的相对空间方向，这是非竞争性结合ELISA的最佳选择。TEM数据显示线性和菱形抗体-抗原复合物的结合方向与两种足迹MS技术所预测的相似。这项研究是首次利用多种自下而上的足迹MS技术和TEM可视化技术来表征用于质量控制（QC）批量释放ELISA的关键试剂的单克隆抗体-抗原结合相互作用。表位在抗原晶体结构上的定位揭示了大约90°的相对空间方向，对于非竞争性结合ELISA来说是最佳的。TEM数据显示线性和钻石抗体-抗原复合物的结合方向与两种足迹MS技术所预测的相似。这项研究是首次利用多种自下而上的足迹MS技术和TEM可视化技术来表征用于质量控制（QC）批量释放ELISA的关键试剂的单克隆抗体-抗原结合相互作用。表位在抗原晶体结构上的定位揭示了大约90°的相对空间方向，对于非竞争性结合ELISA来说是最佳的。TEM数据显示线性和菱形抗体-抗原复合物的结合方向与两种足迹MS技术所预测的相似。这项研究是首次利用多种自下而上的足迹MS技术和TEM可视化技术来表征用于质量控制（QC）批量释放ELISA的关键试剂的单克隆抗体-抗原结合相互作用。

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