Abstract We present a red deer-specific real-time PCR assay which, combined with a reference real-time PCR assay published previously, allows the quantification of the red deer content in food products. Thus, it can be applied to detect food adulteration. The primer/probe system of the red deer-specific real-time PCR assay amplifies a 87 bp long fragment of the protein kinase C iota gene. To eliminate cross-reactivity with closely related species, the forward primer was designed to contain one deliberate base mismatch adjacent to one red deer-specific base. The red deer-specific real-time PCR assay did not show cross-reactivity with 23 animal and 50 plant species tested. LOD and LOQ, determined by analyzing a serially diluted DNA extract containing 1% (w/w) red deer DNA in pig DNA, were 0.05% and 0.4%, respectively. The accuracy was validated by analyzing DNA mixtures, meat extract mixtures, meat mixtures and model game sausages with known red deer content. The highest accuracy was obtained when the calibration mixture was similar to the analyzed sample in both the composition and concentration of the animal species of interest. High recoveries were not only obtained for raw samples but also after subjection to thermal treatment, including brewing (15 min at 75–78 °C), boiling (90 min at 100 °C) and microwave treatment (15 s, 40 s or 2 min at 650 W). The red deer-specific real-time PCR assay was found to be robust with respect to small deviations in the reaction volume or the annealing temperature and the use of another real-time PCR instrument.

中文翻译：

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用于检测食品掺假的马鹿 (Cervus elaphus) 特异性实时 PCR 检测

摘要 我们提出了一种马鹿特异性实时 PCR 检测，结合之前发表的参考实时 PCR 检测，可以对食品中的马鹿含量进行定量。因此，它可用于检测食品掺假。马鹿特异性实时 PCR 检测的引物/探针系统扩增了 87 bp 长的蛋白激酶 C iota 基因片段。为了消除与密切相关物种的交叉反应，正向引物被设计为包含一个与马鹿特定碱基相邻的故意碱基错配。马鹿特异性实时 PCR 检测未显示与测试的 23 种动物和 50 种植物物种发生交叉反应。LOD 和 LOQ 通过分析猪 DNA 中含有 1% (w/w) 红鹿 DNA 的连续稀释 DNA 提取物确定，分别为 0.05% 和 0.4%。通过分析具有已知马鹿成分的 DNA 混合物、肉提取物混合物、肉混合物和模型猎物香肠来验证准确性。当校准混合物在目标动物物种的组成和浓度方面与分析样品相似时，可获得最高准确度。不仅原始样品而且经过热处理，包括酿造（75–78 °C 下 15 分钟）、煮沸（100 °C 下 90 分钟）和微波处理（15 秒、40 秒或 2 650 瓦时最低）。发现马鹿特异性实时 PCR 检测在反应体积或退火温度的小偏差以及使用另一种实时 PCR 仪器方面是稳健的。当校准混合物在目标动物物种的组成和浓度方面与分析样品相似时，可获得最高准确度。不仅原始样品而且经过热处理，包括酿造（75–78 °C 下 15 分钟）、煮沸（100 °C 下 90 分钟）和微波处理（15 秒、40 秒或 2 650 瓦时最低）。发现马鹿特异性实时 PCR 检测在反应体积或退火温度的小偏差以及使用另一种实时 PCR 仪器方面是稳健的。当校准混合物在目标动物物种的组成和浓度方面与分析样品相似时，可获得最高准确度。不仅原始样品而且经过热处理，包括酿造（75–78 °C 下 15 分钟）、煮沸（100 °C 下 90 分钟）和微波处理（15 秒、40 秒或 2 650 瓦时最低）。发现马鹿特异性实时 PCR 检测在反应体积或退火温度的小偏差以及使用另一种实时 PCR 仪器方面是稳健的。不仅原始样品获得高回收率，而且经过热处理，包括酿造（75–78 °C 下 15 分钟）、煮沸（100 °C 下 90 分钟）和微波处理（15 秒、40 秒或 2 650 瓦时最低）。发现马鹿特异性实时 PCR 检测在反应体积或退火温度的小偏差以及使用另一种实时 PCR 仪器方面是稳健的。不仅原始样品而且经过热处理，包括酿造（75–78 °C 下 15 分钟）、煮沸（100 °C 下 90 分钟）和微波处理（15 秒、40 秒或 2 650 瓦时最低）。发现马鹿特异性实时 PCR 检测在反应体积或退火温度的小偏差以及使用另一种实时 PCR 仪器方面是稳健的。