生命体系中的化学反应大多借助于酶的催化来实现,参与这类反应的酶大多是蛋白质。从原子分辨率水平上阐述酶催化反应的动态学对不但对了解酶的具体催化机制有重要的意义,并且在此基础上设计有效的小分子抑制剂有极大帮助。但是非平衡态下的酶催化反应中间体的三维构象测定对于当前的生物物理技术具有较大的挑战,这主要在于中间体的含量通常较低(<15%)并且寿命短,结构性限制条件很难在短时间内获得。最近南开大学的苏循成(点击查看介绍)团队通过顺磁核磁共振的方法建立了一套测定这类瞬态酶催化中间体的方法。
金黄色葡萄球菌Sortase A具有特殊的催化功能,而被广泛应用于蛋白质生物共价修饰中,并且还是设计抗生素的一个重要靶标。南开大学团队以金黄色葡萄球菌Sortase A为目标蛋白,通过该团队多年来积累的蛋白质顺磁标记技术并利用高分辨核磁共振解决测定了Sortase A与QALPETG底物形成的硫酯中间体的三维结构。该团队首先利用高分辨的核磁共振技术在溶液中通过改变反应条件发现Sortase A与QALPETG反应过程中可以观察到微量的核磁信号,并且这些新产生的信号在短时间内(<3小时)逐渐消失并且是主要信号的20%以内。
通过质谱发现这类新的信号就是Sortase A与多肽形成的硫酯中间体。由于硫酯中间体的寿命短并且含量低,生物核磁研究中通常的结构性约束条件很难在短时间内定量采集,因此测定该类中间体的三维结构具有较高的挑战。借助该团队多年顺磁核磁共振研究中的积累,尝试通过利用赝接触位移(pseudocontact shift, PCS)为结构限制性条件. PCS在传统有机化学分析中发挥了重要作用特别是镧系位移试剂,由于高场核磁谱仪的普及,人们不在借助镧系位移试剂来分析重叠的核磁信号。但是PCS在结构生物学中的作用虽然经过Ivano Bertini教授(作者博后导师)为代表的推动和发展,人们逐渐开始在生物核磁研究中利用PCS。根据该团队多年的研究经验,PCS的优点不仅包含了生物大分子中的结构和距离信息,还有一个重要的优势在于可以定量测定,并且可以在短时间内测定,这尤其适合于不稳定的反应体系。
Sortase A含有一个催化活性中心Cys184,在不改变酶催化活性的基础上对蛋白质进行定点修饰需要设计刚性的顺磁探针,另外Sortase A还需要钙离子的参与来提高其催化活性。因此对Sortase A的定点顺磁标记不仅要避免影响Cys184的活性并且还需要克服顺磁探针对钙离子的影响。为实现这一目标,该团队发展了一类在多巯基存在下选择性定点修饰蛋白质的方法,并通过顺磁探针选择性结合镧系离子从而避免了与钙离子的竞争。通过短时间内测定的PCS,利用PCS成功测定了Sortase A与QALPETG形成中间体的三维结构。该类中间体的三维构象与通常的二硫键类似物在酶催化活性中心有显著不同。
利用该类顺磁核磁共振技术测定蛋白质结构的前提是中间体与酶在核磁共振谱中处于慢交换。由于发生在毫秒尺度的蛋白质动态学与大多数蛋白酶的催化过程有关,在非平衡态真实反应体系中测定这类酶的催化中间体无疑会对催化反应机制有更深刻的理解。
这一成果近期发表在《Angew. Chem. Int. Ed.》上,文章的第一作者是南开大学博士研究生陈家良。
该论文作者为:Jia-Liang Chen, Xiao Wang, Feng Yang, Chan Cao, Gottfried Otting, Xun-Cheng Su
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3D Structure determination of an unstable transient enzyme intermediate by paramagnetic NMR spectroscopy
Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 13744-13748, DOI: 10.1002/anie.201606223
苏循成博士简介
苏循成,南开大学元素有机化学国家重点实验室研究员。2001年于南开大学取得博士学位,2001-2004年和2004-2010年分别在意大利佛罗伦萨大学欧盟磁共振中心和澳大利亚国立大学工作,2010年9月起就职于南开大学。
研究领域是化学生物学和生物核磁共振。在相关领域发表SCI论文50余篇,包括以通讯作者发表的Angew. Chem., J. Biomol. NMR, PCCP, Chem. Commun. 和Chem. Eur. J. 等。
http://www.x-mol.com/university/faculty/11898
http://skleoc.nankai.edu.cn/professors/sxc/sxc.html
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