使用三通道荧光探针在细胞和小鼠模型中评估慢性汞暴露及其诱导的氧化应激

汞离子（Hg²⁺）引起的环境污染严重威胁着人类的健康，具有严重的细胞毒性。因此，汞中毒可引起许多疾病，例如中枢神经系统损伤、各种认知和运动障碍、肾衰竭甚至死亡。研究表明，Hg²⁺可以损伤许多器官，但肾脏受到的伤害尤其严重。虽然汞中毒的治疗可用许多药物如亚硒酸钠，但其治疗效果相对较差。即使服药后，Hg²⁺对人类健康的损害仍在继续。该病机制的解释尚未阐明，研究认为上述原因与细胞内氧化还原酶的损伤和Hg²⁺诱导的氧化应激有着密切的关系。

由于氧化应激和Hg²⁺之间复杂的机制涉及许多生理和病理过程，氧化应激和Hg²⁺的相互作用已成为有价值的研究领域，需要进一步验证。然而到目前为止，还没有有效的化学工具用于细胞和体内的氧化应激和Hg²⁺联合检测。海南医学院功能材料与分子影像研究所及中科院烟台海岸带研究所合作设计了一种三通道比率荧光探针HCy-SeH用于O₂^•-和Hg²⁺联合检测。

探针分子结构和对O₂^•-/Hg²⁺联合检测的机制

该研究将总体超氧阴离子（O₂^•-）浓度作为整体活性氧浓度，探针的荧光响应从氢化花菁荧光团部分的攫氢反应开始。一旦探针被O₂^•-氧化，HCy-SeH将其π-共轭体系恢复至七甲川花菁衍生物Cy-SeH。Cy-SeH与其酸碱共轭Cy=Se共存。一种发出红色荧光，另一种发出绿色荧光。响应单元硒醇（-SeH）可以通过Se-Hg拮抗反应捕获Hg²⁺，最终得到发橙色光的终产物酮式花菁（Keto-Cy）。该探针对O₂^•-和Hg²⁺具有高选择性和灵敏度，当应用于HEK 293细胞中的O₂^•-和Hg²⁺联合成像检测时，实验结果表明该探针可以实时和原位联合响应O₂^•-和Hg²⁺。流式细胞术分析与荧光成像结果一致。将探针应用于小鼠模型中的O₂^•-和Hg²⁺成像联合检测时，研究者发现Hg²⁺主要在肾脏中积累并诱导O₂^•-的爆发。实验结果确认慢性汞中毒可引起严重的肾脏氧化损伤和肾纤维化。HCy-SeH进一步提供了新的信息：即使细胞内Hg²⁺已被拮抗，由汞中毒所引起的O₂^•-爆发仍然持续。因此，Hg²⁺所引起的生物体损害可能会长期持续。这些结果强调了该探针可以作为体外和体内O₂^•-和Hg²⁺联合检测的有力工具。该研究致力于将该探针用于临床手术预评估。

利用共聚焦显微镜在HEK 293细胞内联合检测O₂^•-和Hg²⁺；成像分析数据、流式细胞仪分析数据和投射电镜检测显示Hg²⁺导致的氧化应激对细胞产生的损伤

利用下动物活体成像系统评估慢性汞中毒小鼠模型中的O₂^•-和Hg²⁺；慢性汞中毒可引起上皮—间质转化（EMT）；连续11天的汞应激导致小鼠的肾小球不完整，可归因于间质纤维化系统性硬化，然后导致肾小球萎缩。在EMT过程中，由于Hg²⁺主要在肾脏皮质中刺激肾脏损伤，纤维母细胞特异性蛋白α-SMA的水平会增加，并且在上皮细胞中表达的蛋白质E-钙粘蛋白的水平将降低。

亚硒酸钠已作为治疗汞中毒的拮抗剂，该研究评估了亚硒酸钠治疗慢性汞的疗效。实验发现，即使对小鼠模型同时使用氯化汞和亚硒酸钠，也会导致肾脏中O₂^•-的严重爆发。结果还显示，可以利用亚硒酸钠治疗慢性汞中毒，在治疗组中α-SMA下调、E-Cadherin上调，但探针HCy-SeH提供了进一步的重要信息，即亚硒酸钠对汞离子的拮抗作用，它不能消除由汞中毒所引起的O₂^•-爆发。该研究提出细胞内抗氧化系统的活性位点主要表现为巯基或硒醇基团，Hg²⁺可以严重破坏这些酶的活性位点，即使Hg²⁺被亚硒酸钠拮抗，生物体也很难在短时间内恢复抗氧化酶的抗氧化功能。因此，该研究建议人们应注意汞中毒治疗过程中氧化应激造成的损害。

这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是中国科学院烟台海岸带研究所的博士研究生王悦，通讯作者为于法标教授和陈令新研究员。

该论文作者为：Yue Wang, Min Gao, Qingguo Chen, Fabiao Yu, Guibin Jiang and Lingxin Chen

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Associated Detection of Superoxide Anion and Mercury(II) under Chronic Mercury Exposure in Cells and Mice Models via a Three-Channel Fluorescent Probe

Anal. Chem., 2018, 90, 9769, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b01442

于法标博士简介

于法标，海南医学院功能材料与分子影像研究所教授；2013年于大连理工大学/中国科学院大连物理化学研究所取得博士学位，2013年8月至2017年9月在中国科学院烟台海岸带研究所工作，2017年10月起就职于海南医学院（海南医科大学）。

于法标

http://www.x-mol.com/university/faculty/49833    

课题组网站

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功能材料和分子影像研究所（Institute of Functional Materials and Molecular Imaging, Hainan Medical University）依托海南医学院（海南医科大学），负责人为于法标教授，博士生导师、海南省百人计划、中国科学院青年创新促进会会员；目前核心成员8名，其中研究员/教授1名、副研究员/副教授3名、助理研究员/讲师4名；博士研究生2名、硕士研究生10名。团队人才队伍学科背景互补、学科结构配置互补，集设计、研发于一体。研究团队建成了包含分子生物学、化学以及医学影像技术等相结合的较为系统完善的科研平台，并可与学校各实验中心实现高效实验共享，为科研人员创造了便利高效的科研条件。研究所占地1000 m²，启动经费1000万元，科研仪器启动经费1100万元，实验室配备包括HITACHI-HT7800透射-扫描电镜、inVia^TMQontor^TM共焦显微拉曼光谱仪、奥林巴斯超分辨FV3000共聚焦显微镜、徕卡SP8WLL白激光共聚焦显微镜、奥林巴斯FV1000激光共聚焦显微镜、冷泉港小动物活体三维多模式成像系统、HORIBA动态光散射仪、FluoroMax-4/PLUS荧光光谱仪、Lambda 950紫外-可见分光光度计、安捷伦制备液相色谱仪和流式细胞仪等大型仪器。

主要研究领域

瞄准精准医学领域发展前沿，基于光学探针和生物材料的研发，整合（荧光/拉曼/核磁）多模态成像，在热带病、肿瘤等疾病可视化影像检测与精准治疗方面开展深入系统的研究。

（1）疾病诊断和治疗：基于化学材料构建分子/纳米影像探针，精准标记疾病病灶，通过成像在细胞和活体层次直接观察药物治疗过程中的病理生理变化和特征，实现热带病、肿瘤等疾病的早期诊断和治疗。

（2）药物研发：通过设计特异性探针，利用影像学分析系统对药物治疗靶点的分子改变成像，直接评价药理作用，大大加快药物的筛选和开发。

（3）光学影像手术导航：发展基于有机小分子/纳米材料的探针，整合多种影像优势，利用个性化的精准治疗手段精确定位热带病、肿瘤等疾病病灶，减少创伤、改善预后。

（4）微流控芯片检测技术：基于微流控芯片上外泌体的分离与检测，发展临床热带病、肿瘤等疾病的早期精准诊断技术和即时检测技术。

团队研究成果

相关成果发表在Journal of the American Chemical Society、Chemical Society Reviews、Advanced Functional Materials、Biomaterials、Analytical Chemistry、Chemical Science、Theranostics、Chemical Communications、Biosensors and Bioelectronics、Chemistry-A European Journal、Trends in Analytical Chemistry、Journal of Material Chemistry A 等SCI期刊80余篇，IF最高40.182，授权专利发明4项。