基于click核酸连接及末端延伸扩增机制的流式微球技术检测植物microRNA

MicroRNA是一类功能性非编码小分子RNA，广泛存在于动、植物体内，在基因表达过程中发挥着重要的调控作用。其中，植物microRNA在植物新陈代谢进程中发挥着至关重要的作用。最近的研究表明，通过食物摄入的外源性植物microRNA有可能会对包含人类在内的哺乳动物的基因表达过程产生调控作用。因此，植物microRNA的灵敏准确检测对于进一步深入了解其生物功能及其对人体健康的影响具有重要的意义。

然而，与人体microRNA不同，植物microRNA中3´末端2-´O-甲基化修饰，由于甲基化基团存在位阻作用，植物microRNA难以作为引物直接引发核酸聚合延伸反应，因此很多直接以microRNA为引物的核酸扩增技术不再适用于植物microRNA的检测。另一方面，由于microRNA分子非常短，其本身也很难直接作为模板进行PCR等扩增反应。陕西师范大学“生化分子与分子诊断研究团队”在前期的研究中曾提出microRNA的短序列非常适合作为模板介导两段DNA寡核苷酸探针的连接反应，连接产物可直接作为后续PCR等扩增反应的模板（Anal. Chem., 2016, 88, 11384; Anal. Chem., 2014, 86, 1076; Chem. Commun., 2013, 49, 10013）。相关连接反应均依赖于核酸连接酶的催化作用，但以RNA为模板连接DNA探针，无论是采用DNA连接酶还是RNA连接酶，连接效率均受到极大的限制。

近日，该团队的刘成辉教授（点击查看介绍）课题组结合植物microRNA介导的基于click化学的循环核酸连接反应（CCNAL）和微球表面末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）引发的无模板核酸延伸扩增机制，建立了一种适用于植物microRNA灵敏检测的流式微球分析技术（CCNAL-TEP）。该CCNAL连接反应无需任何酶的催化作用，无论是以DNA还是以RNA为连接模板，均能获得很高的连接效率，克服了传统连接酶反应固有的不足。需要指出的是，在常规的click核酸连接反应中，非特异性连接往往是难以避免的。作者在研究中发现，在click核酸连接体系中引入一定的表面活性剂，几乎能够完全抑制非特异性连接，即便是在若干热循环之后，非特异性连接背景都能得到非常好的控制，这一发现对基于click核酸连接反应的生物传感系统和生物材料构建都具有非常好的借鉴意义。

在该CCNAL-TEP检测体系中，经热循环反应，每个靶标植物microRNA分子均能介导多次click核酸连接反应，从而在微球表面引入大量包含3´-OH末端的连接产物。TdT是一种无需模板、非序列依赖的DNA末端延伸酶，能识别微球表面由于连接反应而引入的3´-OH末端，引发末端DNA聚合反应，生成长达数千核苷酸长度的poly(T)长尾，每个poly(T)又能结合大量荧光素标记的(A)25序列，使微球表面富集大量的荧光信号。最后，他们利用流式细胞仪对每个微球的荧光信号进行逐一快速、灵敏检测，即可实现植物microRNA的定量检测。通过结合click循环核酸连接与TdT延伸反应的双重信号放大机制以及灵敏高效的流式微球信号读出方式，该方法获得了很高的灵敏度。植物microRNA ath-miR156a的检出限为5 fM，并成功用于实际样品拟南芥中ath-miR156a含量的准确测定。

图1. 基于CCNAL-TEP的流式微球技术检测植物microRNA的示意图

这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是陕西师范大学的硕士研究生范文娇，通讯作者为刘成辉教授。

该论文作者为：Wenjiao Fan, Yan Qi, Liying Qiu, Pan He, Chenghui Liu and Zhengping Li

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Click Chemical Ligation-Initiated On-Bead DNA Polymerization for the Sensitive Flow Cytometric Detection of 3′-Terminal 2′-O-Methylated Plant MicroRNA

Anal. Chem., 2018, 90, 5390, DOI: 10.1021/acs.analchem.8b00589

导师介绍

刘成辉

http://www.x-mol.com/university/faculty/12383