预测药物肝毒性的新方法

注：文末有本文作者科研思路分析

药物引发的肝毒性（DILI）是目前制药产业面临的难题，药物上市后经常会因为引发肝脏毒性而遭到退市或黑盒警告。近年來，中药引起的肝毒性也越來越受到重视。那么，是否可能在药物临床前的研究阶段就提前预测肝毒性呢？近日，澳门科技大学中药质量研究国家重点实验室的刘良讲座教授（点击查看介绍）和李娜助理教授（点击查看介绍）团队建立了一种可以在临床前评估药物可能引发肝损伤的有效方法。

越来越多的研究表明，药物活性代谢产物（RMs）与蛋白质的共价键结合是引发肝毒性的重要原因。但是，这种由RMs和蛋白质形成的共价键结合物在复杂的生物体系内含量很低，很容易受到高丰度蛋白的干扰，目前还没有合适的方法来评估由此引发的肝毒性。在该研究中，作者提出了一种新的研究策略，首先将药物与肝微粒体和模型氨基酸一起孵育，通过UHPLC-Q-TOF-MS确定RMs对氨基酸的修饰能力和方式，同时建立了一种在线2D-nano-LC-Q-TOF-MS的新方法。该方法具有高效的色谱分离效率，通过对复杂体系中蛋白质的分离、高灵敏度nanospray-MS的检测鉴定低丰度RMs-蛋白质复合物。基于以上方法，他们借助Mascot软件，可以实现微量的RMs-蛋白质复合物在复杂微粒体蛋白质中的快速分离、检测和鉴定。最后，作者通过生物通路分析软件（IPA）研究RMs修饰蛋白质的功能和肝毒性的关系，预测药物引发肝损伤的可能性。利用这一策略，作者研究了一种可以引发肝毒性、并具有复杂结构的中药川楝活性成分——川楝素对蛋白质的共价键修饰作用，发现21种蛋白质可与其RMs产生共价键结合，其中10种蛋白质已有文献报道与肝毒性有关。

该方法侧重于在复杂的生物样品中，通过研究药物及其RMs与蛋白质的共价键修饰作用来评估潜在的肝毒性，无需对药物进行复杂的前处理，因此可以作为一种颇有应用价值的方法来预测潜在药物引发的肝毒性，尤其是对结构复杂的化合物。

相关成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是澳门科技大学的博士研究生卓越和助理教授伍建林，通讯作者为刘良讲座教授和李娜助理教授。

该论文作者为：Yue Zhuo, Jian-Lin Wu, Xiaojing Yan, Ming-Quan Guo, Ning Liu, Hua Zhou, Liang Liu, Na Li

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面，或点此查看原文）：

Strategy for Hepatotoxicity Prediction Induced by Drug Reactive Metabolites Using Human Liver Microsome and Online 2D-Nano-LC-MS Analysis

Anal. Chem., 2017, 89, 13167, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b02684

导师介绍

刘良

http://www.x-mol.com/university/faculty/49514

李娜

http://www.x-mol.com/university/faculty/49515

科研思路分析

Q：这项研究最初是什么目的？或者说想法是怎么产生的？

A：中、西药物引发的肝毒性是一种常见的药物毒副作用，常常导致药物的退市或者黑盒警告，因此现今的药物临床前研究非常注意肝毒性评价。但是目前评价的手段多侧重在药物本身或者其稳定代谢产物产生的肝毒性，而由于缺乏有效的评价方法，RMs产生的肝毒性在临床前研究中很难发现。以往的研究表明，这种毒性作用与RMs对蛋白质的共价键修饰有关，因此我们从这个机制出发，提出了本文的研究策略，希望能建立一种简单、有效的临床前肝毒性评价的方法；同时，该方法对于目前临床使用中存在肝毒性药物的毒性机制也可以阐明。

Q：研究过程中遇到哪些挑战？

A：该研究中的困难是如何从数量众多、含量差别非常大的复杂生物体蛋白质中检测出含量极低的RMs修饰的蛋白质，这也是本研究中的核心问题。我们采用两种方法解决该问题：第一步，在人肝微粒体的作用下，通过研究RMs对模型氨基酸的修饰作用，确定其对蛋白质可能的修饰位点及修饰方式，这些信息可以帮助我们在利用Mascot软件进行蛋白质鉴定时，快速找到潜在的修饰蛋白质，而非大海捞针似的盲目搜索；第二步，建立了一种高效的在线2D-nano-LC-Q-TOF-MS的方法，通过提高分离效率和灵敏度提高微量蛋白质成分检出的可能性。

还有一点需要强调的是，我们在复杂化合物肝毒性的研究中，常常面临的问题是不能确定其中的哪些基团会产生肝毒性。而这个问题需要采用常规的免疫抗体识别法、生物素标记法等方法首先解决。我们建立的上述方法无需对该类问题进行预先了解，因此对复杂化合物潜在肝毒性的研究较为适合。