Herein we exploited a novel target-initiated labeling strategy for the multiplex detection of microRNAs (miRNAs) by coupling duplex-specific nuclease (DSN) with terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT). In the presence of target miRNA, the immobilized and 3'-blocked capture probes hybridized with target and thus the formed DNA-RNA hybrid was recognized by DSN. DSN mediated the digestion of 3'-phosphated capture probes (CPs) in the hybrids and synchronously target was released and recycled for another round of hybridization and cleavage. The cleaved CP fragments with a free 3'-OH were then elongated and labeled with multiple biotin-dUTP nucleotides by TdT. Fluorescence reporter streptavidin-phycoerythin was finally added to react with the immobilized biotins and render fluorescence signals. This dual-amplification labeling strategy was successfully demonstrated to sensitively detect multiple miRNAs, taking advantage of DSN-mediated target recycling and TdT-catalyzed multiple signal modification with analysis by a commercial Luminex xMAP array platform. Our experimental results showed the simultaneous quantitative measurement of three sequence-specific miRNAs at concentrations from 1 pM to 2.5 nM. Attempts were also made to directly detect miRNAs in total RNA extracted from cancer cells. The dual-amplification labeling strategy reported here shows a great potential for the development of a method for the multiplexed, sensitive, selective, and simple analysis of multiple miRNAs in tissues or cells for biomedical research and clinical early diagnosis.

中文翻译：

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用于多重 microRNA 双重扩增检测的靶标起始标记

在此，我们通过将双链特异性核酸酶 (DSN) 与末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 偶联，开发了一种新的靶标启动标记策略，用于 microRNA (miRNA) 的多重检测。在目标miRNA存在的情况下，固定的和3'-封闭的捕获探针与目标杂交，从而形成的DNA-RNA杂交体被DSN识别。DSN 介导了杂交体中 3'-磷酸化捕获探针 (CP) 的消化，同时靶标被释放并回收用于另一轮杂交和切割。然后将带有游离 3'-OH 的切割的 CP 片段拉长，并通过 TdT 用多个生物素-dUTP 核苷酸标记。最后加入荧光报告分子链霉亲和素-藻红蛋白，与固定的生物素反应并呈现荧光信号。利用 DSN 介导的靶标回收和 TdT 催化的多重信号修饰以及商业 Luminex xMAP 阵列平台的分析，这种双扩增标记策略已被成功证明可以灵敏地检测多个 miRNA。我们的实验结果表明，可以同时定量测量浓度为 1 pM 至 2.5 nM 的三种序列特异性 miRNA。还尝试直接检测从癌细胞中提取的总 RNA 中的 miRNA。此处报道的双扩增标记策略显示出开发用于生物医学研究和临床早期诊断的组织或细胞中多种 miRNA 的多重、灵敏、选择性和简单分析方法的巨大潜力。利用 DSN 介导的目标回收和 TdT 催化的多重信号修饰，并通过商业 Luminex xMAP 阵列平台进行分析。我们的实验结果表明，可以同时定量测量浓度为 1 pM 至 2.5 nM 的三种序列特异性 miRNA。还尝试直接检测从癌细胞中提取的总 RNA 中的 miRNA。此处报道的双扩增标记策略显示出开发用于生物医学研究和临床早期诊断的组织或细胞中多种 miRNA 的多重、灵敏、选择性和简单分析方法的巨大潜力。利用 DSN 介导的目标回收和 TdT 催化的多重信号修饰，并通过商业 Luminex xMAP 阵列平台进行分析。我们的实验结果表明，可以同时定量测量浓度为 1 pM 至 2.5 nM 的三种序列特异性 miRNA。还尝试直接检测从癌细胞中提取的总 RNA 中的 miRNA。此处报道的双扩增标记策略显示出开发用于生物医学研究和临床早期诊断的组织或细胞中多种 miRNA 的多重、灵敏、选择性和简单分析方法的巨大潜力。我们的实验结果表明，可以同时定量测量浓度为 1 pM 至 2.5 nM 的三种序列特异性 miRNA。还尝试直接检测从癌细胞中提取的总 RNA 中的 miRNA。此处报道的双扩增标记策略显示出开发用于生物医学研究和临床早期诊断的组织或细胞中多种 miRNA 的多重、灵敏、选择性和简单分析方法的巨大潜力。我们的实验结果表明，可以同时定量测量浓度为 1 pM 至 2.5 nM 的三种序列特异性 miRNA。还尝试直接检测从癌细胞中提取的总 RNA 中的 miRNA。此处报道的双扩增标记策略显示出开发用于生物医学研究和临床早期诊断的组织或细胞中多种 miRNA 的多重、灵敏、选择性和简单分析方法的巨大潜力。