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Cell Lysate-Based AlphaLISA Deubiquitinase Assay Platform for Identification of Small Molecule Inhibitors
ACS Chemical Biology ( IF 3.5 ) Pub Date : 2017-08-24 00:00:00 , DOI: 10.1021/acschembio.7b00543 Christine A. Ott 1 , Bolormaa Baljinnyam 2 , Alexey V. Zakharov 2 , Ajit Jadhav 2 , Anton Simeonov 2 , Zhihao Zhuang 1
ACS Chemical Biology ( IF 3.5 ) Pub Date : 2017-08-24 00:00:00 , DOI: 10.1021/acschembio.7b00543 Christine A. Ott 1 , Bolormaa Baljinnyam 2 , Alexey V. Zakharov 2 , Ajit Jadhav 2 , Anton Simeonov 2 , Zhihao Zhuang 1
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The deubiquitinases, or DUBs, are associated with various human diseases, including neurological disorders, cancer, and viral infection, making them excellent candidates for pharmacological intervention. Drug discovery campaigns against DUBs require enzymatic deubiquitination assays amenable for high-throughput screening (HTS). Although several DUB substrates and assays have been developed in recent years, they are largely limited to recombinantly purified DUBs. Many DUBs are large multidomain proteins that are difficult to obtain recombinantly in sufficient quantities for HTS. Therefore, an assay that obviates the need of recombinant protein generation and also recapitulates a physiologically relevant environment is highly desirable. Such an assay will open doors for drug discovery against many therapeutically relevant, but currently inaccessible, DUBs. Here, we report a cell lysate DUB assay based on AlphaLISA technology for high throughput screening. This assay platform uses a biotin-tagged ubiquitin probe and a HA-tagged DUB expressed in human cells. The assay was validated and adapted to a 1536-well format, which enabled a screening against UCHL1 as proof of principle using a library of 15 000 compounds. We expect that the new platform can be readily adapted to other DUBs to allow the identification of more potent and selective small molecule inhibitors and chemical probes.
中文翻译：
基于细胞裂解物的AlphaLISA去泛素酶测定平台，用于鉴定小分子抑制剂
去泛素酶或DUBs与多种人类疾病有关，包括神经系统疾病，癌症和病毒感染，使其成为药物干预的极佳候选者。针对DUB的药物发现运动需要适用于高通量筛选（HTS）的酶促去泛素化验。尽管近年来已经开发了几种DUB底物和检测方法，但它们很大程度上限于重组纯化的DUB。许多DUB是大型的多域蛋白，很难以足够的量重组获得用于HTS的蛋白。因此，非常需要消除重组蛋白产生的需要并且还概括生理相关环境的测定法。这种分析将为针对许多与治疗相关但目前尚无法获得的药物进行药物发现打开大门，DUB。在这里，我们报告基于AlphaLISA技术的细胞裂解物DUB分析用于高通量筛选。该测定平台使用在人细胞中表达的生物素标记的泛素探针和HA标记的DUB。该测定方法经过验证，并适用于1536孔形式，可使用1500种化合物的库对UCHL1进行筛选，作为原理证明。我们希望新平台可以轻松适应其他DUB，以识别更有效和更具选择性的小分子抑制剂和化学探针。通过使用15 000种化合物的文库，可以对UCHL1进行筛选，作为原理验证。我们希望新平台可以很容易地适应其他DUB，从而可以鉴定出更有效和更具选择性的小分子抑制剂和化学探针。通过使用15 000种化合物的文库，可以对UCHL1进行筛选，作为原理验证。我们希望新平台可以很容易地适应其他DUB，从而可以鉴定出更有效和更具选择性的小分子抑制剂和化学探针。
更新日期：2017-08-24
中文翻译：
基于细胞裂解物的AlphaLISA去泛素酶测定平台，用于鉴定小分子抑制剂
去泛素酶或DUBs与多种人类疾病有关，包括神经系统疾病，癌症和病毒感染，使其成为药物干预的极佳候选者。针对DUB的药物发现运动需要适用于高通量筛选（HTS）的酶促去泛素化验。尽管近年来已经开发了几种DUB底物和检测方法，但它们很大程度上限于重组纯化的DUB。许多DUB是大型的多域蛋白，很难以足够的量重组获得用于HTS的蛋白。因此，非常需要消除重组蛋白产生的需要并且还概括生理相关环境的测定法。这种分析将为针对许多与治疗相关但目前尚无法获得的药物进行药物发现打开大门，DUB。在这里，我们报告基于AlphaLISA技术的细胞裂解物DUB分析用于高通量筛选。该测定平台使用在人细胞中表达的生物素标记的泛素探针和HA标记的DUB。该测定方法经过验证，并适用于1536孔形式，可使用1500种化合物的库对UCHL1进行筛选，作为原理证明。我们希望新平台可以轻松适应其他DUB，以识别更有效和更具选择性的小分子抑制剂和化学探针。通过使用15 000种化合物的文库，可以对UCHL1进行筛选，作为原理验证。我们希望新平台可以很容易地适应其他DUB，从而可以鉴定出更有效和更具选择性的小分子抑制剂和化学探针。通过使用15 000种化合物的文库，可以对UCHL1进行筛选，作为原理验证。我们希望新平台可以很容易地适应其他DUB，从而可以鉴定出更有效和更具选择性的小分子抑制剂和化学探针。
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