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Rational Modular RNA Engineering Based on In Vivo Profiling of Structural Accessibility
ACS Synthetic Biology ( IF 3.7 ) Pub Date : 2017-08-10 00:00:00 , DOI: 10.1021/acssynbio.7b00185 Abigail N. Leistra 1 , Paul Amador 2 , Aishwarya Buvanendiran 3 , Alex Moon-Walker 3 , Lydia M. Contreras 1
ACS Synthetic Biology ( IF 3.7 ) Pub Date : 2017-08-10 00:00:00 , DOI: 10.1021/acssynbio.7b00185 Abigail N. Leistra 1 , Paul Amador 2 , Aishwarya Buvanendiran 3 , Alex Moon-Walker 3 , Lydia M. Contreras 1
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Bacterial small RNAs (sRNAs) have been established as powerful parts for controlling gene expression. However, development and application of engineered sRNAs has primarily focused on regulating novel synthetic targets. In this work, we demonstrate a rational modular RNA engineering approach that uses in vivo structural accessibility measurements to tune the regulatory activity of a multisubstrate sRNA for differential control of its native target network. Employing the CsrB global sRNA regulator as a model system, we use published in vivo structural accessibility data to infer the contribution of its local structures (substructures) to function and select a subset for engineering. We then modularly recombine the selected substructures, differentially representing those of presumed high or low functional contribution, to build a library of 21 CsrB variants. Using fluorescent translational reporter assays, we demonstrate that the CsrB variants achieve a 5-fold gradient of control of well-characterized Csr network targets. Interestingly, results suggest that less conserved local structures within long, multisubstrate sRNAs may represent better targets for rational engineering than their well-conserved counterparts. Lastly, mapping the impact of sRNA variants on a signature Csr network phenotype indicates the potential of this approach for tuning the activity of global sRNA regulators in the context of metabolic engineering applications.
中文翻译：
基于结构可及性体内分析的合理模块化RNA工程
细菌小RNA（sRNA）已被确立为控制基因表达的强大组成部分。但是，工程sRNA的开发和应用主要集中在调节新型合成靶标上。在这项工作中，我们演示了一种合理的模块化RNA工程方法，该方法使用体内结构可及性测量方法来调节多底物sRNA的调节活性，以对其天然靶标网络进行差异控制。我们使用CsrB全球sRNA调节剂作为模型系统，使用了在体内发表的文章结构可访问性数据，以推断其局部结构（子结构）对功能的贡献并选择工程子集。然后，我们以模块化方式重组选定的子结构，以差异方式表示假定的功能贡献高或低的子结构，以构建21个CsrB变体的库。使用荧光翻译记者测定法，我们证明了CsrB变体实现了特征明确的Csr网络目标控制的5倍梯度。有趣的是，结果表明，长的，多底物的sRNA中保守程度较低的局部结构可能比保守的对应结构更好地代表了合理的工程学目标。最后，
更新日期：2017-08-10
中文翻译：
基于结构可及性体内分析的合理模块化RNA工程
细菌小RNA（sRNA）已被确立为控制基因表达的强大组成部分。但是，工程sRNA的开发和应用主要集中在调节新型合成靶标上。在这项工作中，我们演示了一种合理的模块化RNA工程方法，该方法使用体内结构可及性测量方法来调节多底物sRNA的调节活性，以对其天然靶标网络进行差异控制。我们使用CsrB全球sRNA调节剂作为模型系统，使用了在体内发表的文章结构可访问性数据，以推断其局部结构（子结构）对功能的贡献并选择工程子集。然后，我们以模块化方式重组选定的子结构，以差异方式表示假定的功能贡献高或低的子结构，以构建21个CsrB变体的库。使用荧光翻译记者测定法，我们证明了CsrB变体实现了特征明确的Csr网络目标控制的5倍梯度。有趣的是，结果表明，长的，多底物的sRNA中保守程度较低的局部结构可能比保守的对应结构更好地代表了合理的工程学目标。最后，
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