摘要

作为一种稳定的活性氧成分（ROS），过氧化氢（H₂O₂）在氧化损伤和细胞信号转导中都发挥着重要的作用，被认为是一把与健康和疾病都息息相关的双刃剑。使用高选择性、高灵敏度的分子探针对细胞内H₂O₂进行定性定量分析，能够帮助人们深入了解H₂O₂在不同生物机制中的调控作用，但也一直极具挑战。

香港大学化学系、晨兴化学生物学实验室的杨丹教授课题组开发了一组新型H₂O₂探针，HKPerox-Red和HKPerox-Ratio，借助精巧设计的串联Payne/Dakin反应，实现了H₂O₂的高灵敏度识别与高选择性检测。其中，释放红色荧光的强度型HKPerox-Red探针能够检测细胞与斑马鱼胚胎在不同条件下，内源产生的H₂O₂；而释放绿色与蓝色荧光的比率型HKPerox-Ratio探针更是通过流式细胞仪与细胞H₂O₂校正曲线，首次实现营养剥夺状态下细胞内H₂O₂浓度的定量分析。由于许多代谢物都能在氧化酶的催化作用下与氧气反应，定量生成H₂O₂，HKPerox-Red更是能用于超灵敏检测葡萄糖、尿酸和肌氨酸等代谢物。这充分证明了串联Payne/Dakin反应策略用于H₂O₂生物成像与分子诊断的巨大潜力，并为H₂O₂相关的基础研究与转化研究提供有力的分子工具。

相关工作以前沿论文 (Edge Article) 的形式发表在英国皇家化学会旗舰期刊 Chemical Science 上，并被选作封面文章（Front Cover）。

论文信息

Fluorescent probes for in vitro and in vivo quantification of hydrogen peroxide

S. Ye, J. J. Hu, Q. A. Zhao, D. Yang*

Chem. Sci. 2020, 11, 11989–11997

研究背景

在生物体的有氧呼吸中，绝大多数的氧气（O₂）在呼吸链中被还原成了水（H₂O）。然而，约有1%的O₂会发生不完全还原，生成超氧根离子（O₂^•−）。超氧根离子可以在体内变成一系列的活性氧成分（ROS），包括H₂O₂、HOCl、^•OH及ONOO⁻等。这些ROS在体内不断地产生，又不断地被抗氧化机制消灭，在氧化应激、细胞分裂分化、免疫激活和衰老等过程中发挥着重要作用。ROS既是许多重大疾病的起因（包括肿瘤、心血管疾病和神经退行性疾病），而精准调控ROS又是许多治疗手段的基础（包括抗氧化、光动力疗法和化学动力疗法）。

不同ROS产生的机理（来源：杨丹课题组Annu. Rev. BioChem. 2019, 88, 605–633.）

这些ROS分子，反应活性较高但又性质迥异。在生物环境中，特异性试别ROS一直都是研究的热点。香港大学杨丹课题组针对不同的ROS，精心调控反应策略，近年来开发了一系列新型荧光探针，包括HKSOX、HKPerox、HKOCl、HKOH和HKGreen/HKYellow 系列分子探针，分别用于高选择性、高灵敏度检测O₂^•−、H₂O₂、HOCl、^•OH及ONOO⁻，并使用这些探针深入探究氧化还原生物学的分子基础，以冀开发新诊断与新治疗。

在所有的ROS中，H₂O₂是最重要的一个信号分子：电中性的H₂O₂反应性能温和，具有较长的渗透距离，甚至还能穿过细胞膜，用于细胞内和跨细胞的信号传导。目前，科学家们的研究揭示了细胞内维持低浓度的H₂O₂能够促进细胞的正常分裂、分化，而高浓度的H₂O₂会导致细胞生长停滞、甚至凋亡。科学家们也开发了多种探针用于H₂O₂的生物成像。然而，由于H₂O₂的反应活性较低，大多数分子探针不可避免地会受到高活性ROS（例如ONOO⁻和HOCl）的干扰。H₂O₂在细胞内的定性监测已经殊为不易，而细胞内源H₂O₂的定量分析更是一大挑战。

本篇论文

在杨丹教授课题组开发的串联Payne/Dakin识别策略中，生理浓度范围内H₂O₂先与三氯乙腈加成，大大增强其反应活性（Payne反应），然后氧化水杨醛识别基团，发生Dakin氧化重排反应，从而释放出荧光基团。串联Payne/Dakin反应策略能够有效满足H₂O₂生物成像中所必需的高灵敏度和高选择性，已经被用于开发了HKPerox-1、HKPerox-2和H₂O₂-CL-510等强度型荧光探针及化学发光探针。然而，之前开发的HKPerox探针无法用于斑马鱼成像和比率成像，更无法用于细胞内源H₂O₂的定量分析。因此，杨丹课题组通过巧妙地调控发光策略与选取合适的荧光团，开发了新一代分子探针HKPerox-Red和HKPerox-Ratio。

首先，作者设计了两条通用的合成路线，用于开发H₂O₂新型分子探针：1. 含卤素/三氟甲磺酸酯荧光团与氨基甲酸酯响应基团的偶联反应；2. 含氨基/异氰酸酯荧光团与苄醇响应基团的加成反应。这两种合成策略分别适用于含羟基荧光团与含氨基荧光团，成功合成了HKPerox-Red与HKPerox-Ratio。

紧接着的H₂O₂反应活性表征，证明了两个探针的优异表现。100 µM的H₂O₂处理后，HKPerox-Red迅速释放强烈的红色荧光，亮度在30分钟内增加了150倍。HKPerox-Red还具有优异的选择性，对其他ROS几乎毫无响应。作为比率型探针，HKPerox-Ratio原本释放蓝色荧光，由于H₂O₂触发的串联Payne/Dakin反应，HKPerox-Ratio的蓝色荧光减弱，绿色荧光增强。绿色荧光强度与蓝色荧光强度的比率与H₂O₂的浓度线性相关，并且自带校正内标，可用于复杂生物环境中H₂O₂定量分析。一系列的测试表明：两个探针均具有高水溶性、高生物相容性、高选择性和高灵敏度，非常适用于H₂O₂的生物成像研究。

HKPerox-Red用于斑马鱼胚胎成像

作者首先在细胞模型上验证了HKPerox-Red能够灵敏地检测出小鼠巨噬细胞的内源性H₂O₂爆发，然后将其用于斑马鱼胚胎成像。由于HKPerox-Red良好的水溶性和亲脂性，简单共孵育之后，探针就能进入斑马鱼胚胎，成功检测出胚胎细胞分裂过程中产生的H₂O₂；然而由于卵黄部位没有胚胎细胞，并没有产生任何H₂O₂，也就没有红色荧光信号。带一个羧酸根的HKPerox-2脂溶性不如HKPerox-Red，因此不能通过共孵育进入斑马鱼胚胎，绿色荧光信号都在受精卵外面。

作者进一步探讨了鱼藤酮对斑马鱼胚胎的作用机制。鱼藤酮是一种从藤本植物提取的广谱杀虫剂，能够抑制细胞呼吸链的正常功能，对昆虫和鱼都有很强的毒性。有机农场经常会使用这种天然的植物性杀虫剂，然而鱼藤酮可能会增加农场工人患上帕金森症的风险。H₂O₂在这个过程中可能起到非常关键的作用。作者使用HKPerox-Red进行的斑马鱼胚胎成像实验证明：经过鱼藤酮处理后，斑马鱼体内确实产生了大量的H₂O₂。这些H₂O₂广泛分布在斑马鱼的脑部和腹部，有可能导致蛋白质、DNA等生物分子的氧化损伤，诱发神经退行性疾病。

HKPerox-Red用于超灵敏检测葡萄糖、尿酸与肌氨酸

血糖的检测也能通过H₂O₂探针HKPerox-Red来实现。传统的血糖仪就是利用葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化成H₂O₂以测定血糖。作者紧接着开发了基于HKPerox-Red的葡萄糖氧化酶/葡萄糖的超灵敏检测方法，针对葡萄糖的检出限为34 nM，比便携式血糖仪灵敏上万倍，稀释1000倍的血清都可以使用该方法进行血糖定量。使用HKPerox-Red进行血糖监测，有望在临床应用中减少采血量，减轻给病人带来的痛苦；也有望通过唾液、泪液和汗液等非侵入性样品，实现无创血糖监测。与不同的氧化酶联用，HKPerox-Red更是构建了一个通用的代谢物检测平台，实现尿酸和肌氨酸的超灵敏检测。

接下来，作者使用HKPerox-Ratio探索H₂O₂的比率型检测。过去几十年，中国科学家发现了As₂O₃在白血病治疗中的关键作用，实现了急性骨髓性白血病治疗领域的重大突破。H₂O₂可能是药物作用效果的关键。然而，常用的白血病细胞株都是悬浮细胞，并不适用于共聚焦显微成像。因此，作者首先使用HKPerox-Ratio进行染色，然后用流式细胞仪同时监测这些悬浮细胞内的蓝色荧光通道与绿色荧光通道。在比率型检测中，绿色荧光与蓝色荧光的比值（F_Green/F_Blue）对应着细胞内H₂O₂浓度。经过As₂O₃处理之后，作者发现三种白血病细胞株的F_Green/F_Blue都发生了显著变化：U-937的F_Green/F_Blue增加了1.9倍、NB4的增加了1.7倍、THP-1的增加了2.8倍。这种荧光比率的增加为As₂O₃刺激白血病细胞内H₂O₂的爆发提供了最有力的证据。HKPerox-Ratio与流式细胞仪联用能够有效筛选与As₂O₃作用机制类似的白血病新药。

HKPerox-Ratio用于细胞比率成像

HKPerox-Ratio还可以用于双通道比率成像。在这个实验中，作者探索了营养剥夺对细胞状态的影响。在对照组中，处于稳态的细胞内H₂O₂浓度较低，所以探针主要发蓝光，而在绿光通道几乎没有信号，因此F_Green/F_Blue仅为~0.2。然而，经过24小时的饥饿处理的细胞，蓝色通道的信号大大减少，而绿色通道的荧光显著增加，F_Green/F_Blue更是增长5倍至~1.0。这充分证明了细胞在营养剥夺的状态下会产生内源的H₂O₂，可能用于调控自噬作用，帮助细胞度过饥饿危机，而长时间的营养剥夺会导致不可逆的氧化损伤，最终导致凋亡。

HKPerox-Ratio用于细胞内H₂O₂定量分析

紧接着，作者使用流式细胞仪对细胞饥饿状态下的产生的H₂O₂进行了定量分析。过去的H₂O₂校正曲线大多在化学体系中获取，未必适用于细胞环境中H₂O₂的定量分析。在本课题中，作者创新地使用流式细胞仪获取了活细胞内的H₂O₂校正曲线。作者发现，3小时的营养剥夺已经显著地增加了细胞内的F_Green/F_Blue比值，对应活细胞H₂O₂校正曲线，相当于产生了7.9 µM的H₂O₂。H₂O₂的浓度在14小时的营养剥夺中到达最大值（34 µM），更长时间的营养剥夺（24小时）并没有进一步增加细胞内H₂O₂的浓度。然而，这个浓度的H₂O₂已经能够诱导一些病理性生物机制，导致生长停滞甚至细胞凋亡。

最后，作者总结道：作为一把双刃剑，H₂O₂在生物体内调控多种重要的生理与病理生物机制。因此，能够对细胞内的H₂O₂实现定性定量分析具有重要的意义。本文开发的两个新型探针HKPerox-Red和HKPerox-Ratio能够用于细胞成像、斑马鱼成像、比率成像和流式细胞仪分析，必将为H₂O₂相关研究提供有力的分子工具，在生物成像、药物筛选和疾病诊断中大有作为。

本文报道的研究工作得到了国家自然科学基金、香港研究资助局卓越学科领域计划、香港大学以及晨兴基金的大力资助。香港大学叶森博士为本文的第一作者，杨丹教授为本文的通讯作者。

作者简介

杨丹教授就职于香港大学化学系，任化学系讲座教授、晨兴化学生物学讲席教授、长江学者讲座教授。1985年复旦大学本科毕业，1988年获得哥伦比亚大学硕士学位，1991年获颁普林斯顿大学博士学位，之后在哈佛大学完成两年博士后研究，1993年起任教于香港大学。杨丹教授团队的研究涉及有机化学和化学生物学，专注于研发小分子探针用于生物体系内活性氧、蛋白、核酸、脂质体的检测和细胞成像，设计人工离子传输体，开发新型活性药物分子，探究生物系统中信号转导过程以及药物靶向蛋白等。杨丹教授研究蜚声国际，获得多个奖项，包括2000年Mr. and Mrs Sun Chan有机化学纪念奖；2001年获布里斯托-梅耶-施宝贵基金会颁发的有机合成化学奖；同年又获颁裘槎基金会高级研究员奖；2003年获中国国家自然科学基金会颁发杰出青年学者奖项；2006年获长江学者（讲座教授，复旦大学，生物有机化学）和礼来亚洲杰出科学奖；以及2007-2008年度的诺华化学奖席；2011年获第七届中国青年女科学家奖；2017年，香港研究资助局卓越学科领域计划“以化学生物学探究分子医学”重大项目首席科学家；2020年获国际有机化学基金会Yoshida奖。杨丹教授现任 Curent Opinions in Chemical Biology 学术期刊的总主编。

叶森，2013年复旦大学化学系本科毕业，2019年获得香港大学博士学位（导师：杨丹教授），之后留课题组从事荧光探针、化学发光探针与超分辨显微成像的博士后研究，探索新型分子工具用于生物成像、疾病诊断与新药筛选。叶森曾获得多项奖励，如教育部珠峰计划（基础学科拔尖学生培养试验计划）、复旦曦源计划、以及香港大学许磐卿研究生科研奖。此外，叶森还是英国皇家化学会Chemical Communications和RSC Chemical Biology等学术期刊的审稿专家。